铁是生物体内重要元素之一,在较多的细胞功能及多种生化过程中发挥着重要作用。虽然铁在土壤中含量丰富,但中性或碱性土壤可供植物吸收的可溶性铁量不能满足植物需要,因此导致的缺铁胁迫限制了植物正常的生长发育。在进化过程中,植物进化了两种适应性机制,命名为机理Ⅰ和机理Ⅱ。两种机理分别通过“还原”和“螯合”完成对铁的吸收。在果树中铁吸收、代谢过程以及细胞水平调控知之甚少,水稻中大量缺铁胁迫上调表达基因的功能也没有完全解析。本论文主要对小金海棠MxIRT1（Iron Regulated Transporter1）蛋白的离子吸收范围、细胞定位和降解途径进行了初步的研究,并且对水稻缺铁条件下上调表达的OsNAT7（Nucleobase-Ascorbate Transporter）基因利用酵母异源互补实验进行了底物转运功能研究的尝试。一、MxIRT1蛋白的离子吸收、细胞定位与降解途径研究果树属于机理Ⅰ植物,负责铁离子吸收的质膜蛋白在应答缺铁胁迫过程中的作用十分关键。小金海棠（Malus xiaojinensis Cheng et Jiang）是苹果属中的铁高效物种。前期工作中,MxIRT1为小金海棠缺铁根cDNA文库中克隆出来和铁吸收相关的基因,其在缺铁条件下上调表达。本文对该基因进行的后续研究有以下几个方面:1.MxIRT1蛋白是可转运Fe、Cd的金属离子转运蛋白序列分析表明,MxIRT1属于ZIP（ZRT/IRT like Protein）家族成员,是众多铁转运蛋白的同源物。为鉴定其转运底物,利用不同酵母突变株进行功能互补实验。结果表明MxIRT1蛋白可以恢复铁吸收突变体DEY1453（fet3fet4）在缺铁培养基上的生长;同时在DY1457菌株中,转有MxIRT1基因的酵母细胞表现对Cd较高的敏感性;通过质谱测定酵母细胞内金属含量的变化,转有MxIRT1基因的酵母细胞内含有较高的金属含量。这两个结果表明MxIRT1蛋白对Fe、Cd的转运作用。在Zn、Mn、Cu吸收的酵母突变株开展的互补实验中没有明显的互补结果,转有MxIRT1基因的DY1457菌株对Co、Ni不敏感,金属离子含量测定没有表现明显差异,表明MxIRT1蛋白对于Zn、Mn、Cu、Co、Ni的转运作用不明显。2.MxIRT1蛋白富含His基序对Fe、Cd的转运表现不同的作用由于MxIRT1蛋白可转运Fe、Cd两种金属元素,其离子选择研究以确保特定离子跨膜转运有着十分重要的意义。据推测,ZIP家族蛋白的可变区中富含组氨酸的基序有金属离子结合的功能。为探讨该功能区域的作用,对MxIRT1蛋白可变区富含组氨酸基序共9个氨基酸的编码核苷酸用PCR的方法进行了删切。删切后的MxIRT1在互补实验结果中表明富含组氨酸的基序对Fe的转运是必须的,但对Cd的转运作用并不必要。这一结果与Connolly实验室点突变的结果不一致,推测这一基序的二级结构对于Fe的转运有作用。3.分泌途径对于MxIRT1蛋白的正确定位十分必要为证实MxIRT1在质膜上发挥离子转运功能,利用MxIRT1::GFP融合蛋白在酵母细胞中研究发现其定位于质膜和胞内的膜（囊）泡内。缺铁条件下（加入铁螯合剂）培养的酵母细胞内,点状绿色荧光增多,暗示膜泡包裹的MxIRT1通过分泌途径完成质膜的定位过程。同时发现删切信号肽的MxIRT1不能发挥Fe、Cd的转运功能证实了信号肽在分泌过程中的作用,也说明分泌途径在蛋白定位中的重要性。4.不同铁离子浓度影响MxIRT1::GFP蛋白定位及蛋白丰度通过对不同铁浓度下MxIRT1::GFP的定位观察,发现缺铁条件下融合蛋白分布在酵母细胞内的点状结构,而正常铁条件下绿色荧光可集中在质膜的部分区域。随着培养基中铁浓度的增高和培养时间的延长,细胞内的荧光强度减弱,暗示了MxIRT1蛋白的降解过程。为进一步探究这一过程,应用带有诱导型启动子的表达载体对铁影响MxIRT1细胞定位及蛋白丰度开展了实验。结果表明:过量诱导表达MxIRT1::GFP融合蛋白的酵母细胞中,在液泡中会出现绿色荧光,荧光强度随铁浓度的增加而增强。暗示了MxIRT1的降解是依赖于液泡的降解途径,外源铁浓度的增加会加速这一过程。通过蛋白印迹的实验表明,过量铁条件下(＞1 mM Fe²⁺)培养的酵母细胞中,MxIRT1::GFP的蛋白丰度下降,而缺铁条件下的蛋白丰度和未处理细胞之间无明显差异。通过MxIRT1::GFP在内吞突变体（end4）酵母细胞中的定位研究发现,绿色荧光仍然可以定位在液泡内,表明降解途径不依赖或不完全依赖END4基因介导的内吞途径,发生降解的蛋白可能来源于新合成的蛋白。而在蛋白酶A突变体（pep4）细胞中,绿色荧光大量在液泡中积累,暗示了降解过程对PEP4基因的依赖。5.MxIRT1蛋白在植物细胞定位于质膜和胞内的膜结构为了解MxIRT1在植物细胞中的定位,分别用瞬时表达载体和稳定表达载体对BY-2原生质体和悬浮细胞进行了转化。发现瞬时表达和稳定表达的MxIRT::GFP融合蛋白定位于质膜和胞内的膜结构上。加铁和缺铁处理其细胞定位和荧光强度未发生变化,暗示植物细胞与酵母细胞的调控机制存在不同,可能需要整个植株或某些器官对铁浓度的反应。6.转基因水稻植株中正、反义表达载体转化的株系T1代种子未表现金属含量的差异为提高水稻籽实中的铁含量,利用苹果属的基因资源对水稻进行了MxIRT1正义、反义载体的转化。鉴定的阳性植株T1代种子中,正、反义表达载体转化的株系和野生型之间未表现差异。表明植株籽实铁含量依赖于铁的转运、分配等多个层次。二、水稻OsNAT7的底物转运研究应用基因芯片研究发现,OsNAT7（Nucleobase-ascorbate transporter7）是水稻缺铁第五天上调表达的基因之一,其上调比率达9.605,序列分析表明其属于碱基-抗坏血酸转运蛋白家族,但其功能及在铁营养相关代谢过程中的作用尚不清楚。本论文开展的研究主要有:转录水平上,OsNAT7基因在水稻根缺铁第5天时呈上调表达,而在缺铁第3天表现下调,缺铁第7天的转录水平与正常铁处理的相比变化不明显,暗示了该基因随铁营养的处理表达量有所区别。利用BY-2悬浮细胞和洋葱表皮开展的细胞定位研究表明OsNAT7主要定位于质膜,部分荧光位于细胞内膜,表明其在底物转运中的作用。为进一步了解其底物,在对该家族已有的研究基础上,通过酿酒酵母中的异源互补实验进行了底物鉴定。分别鉴定了腺嘌呤、次黄嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、尿酸、腺苷、鸟苷等物质,但未鉴定出其转运底物。表明酵母异源互补实验对于NAT家族底物的研究并不适合,OsNAT7的底物鉴定可能还需要构巢曲霉（Aspergillus nidulans）的异源表达系统。