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第一章人脂肪间充质干细胞分离、培养及鉴定目的探讨自人固态脂肪中分离、培养脂肪间充质干细胞(AMSCs)的方法及所获得细胞表达表面抗原的情况。方法自行髋关节手术的患者获取固态皮下脂肪组织,将脂肪组织以Ⅰ型胶原酶消化获取贴壁细胞。细胞置于含10%新生牛血清的低糖DMEM培养基中培养,镜下观察细胞形态。MTT法测定第3、6、9代细胞增殖情况,绘制生长曲线图。流式细胞仪检测第6代细胞CD29和CD44表达情况。结果原代细胞培养24小时后即可见细胞贴壁;1周后细胞增殖速度加快,呈漩涡状生长,细胞呈长梭形。传代后细胞贴壁和增殖速度明显加快。生长曲线图显示第3、6代细胞增殖能力较强,而第9代细胞增殖能力下降。流式细胞仪检测显示第6代AMSCs有97%表达CD29,95%表达CD44。结论自人固态脂肪组织提取间充质干细胞分离简便、提取容易、细胞纯度高,增殖能力强,符合软骨组织工程种子细胞的基本条件。第二章IGF-1对AMSCs向软骨细胞定向诱导分化的影响目的探讨IGF-1诱导AMSCs向软骨细胞定向分化的可能性及在诱导分化中和TGF-β1的相互作用。方法获取AMSCs,以2×10~5cells/cm~2的密度接种于培养瓶,使用含IGF-1或(和)TGF-β1的无胰岛素软骨诱导剂诱导AMSCs,观察细胞聚集情况。2周后获取细胞,制备细胞爬片,进行甲苯胺兰染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色,观察细胞内高硫酸化的蛋白聚糖和Ⅱ型胶原着色情况。RT-PCR检测Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan及Sox9 mRNA的表达。Western blot检测Ⅱ型胶原蛋白及aggrecan的表达。结果加入诱导剂后,AMSCs自行聚集成放射状的细胞团,其中IGF+TGF组细胞聚集成肉眼可见的大细胞团。甲苯胺兰染色显示三个诱导组细胞呈多角形,胞浆及胞膜呈蓝色异染。Ⅱ型胶原免疫组化染色显示三个诱导组细胞胞浆及胞膜呈棕黄色着色。RT-PCR检测显示IGF+TGF组Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan、Sox9 mRNA的表达均显著强于IGF组和TGF组,IGF组和TGF组显著强于对照组,而IGF组与TGF组无显著性差异。Western blot检测显示IGF+TGF组Ⅱ型胶原蛋白及aggrecan的表达显著强于IGF组和TGF组,IGF组和TGF组显著强于对照组,而IGF组与TGF组无显著性差异。结论IGF-1可以单独诱导高密度单层培养的AMSCs向软骨细胞分化,表达软骨细胞特异性细胞表型,IGF-1与TGF-β1诱导AMSCs向软骨细胞分化有协同作用。第三章AMSCs复合聚乳酸-己内酯共聚物支架体外诱导成软骨的实验研究目的探讨聚乳酸/己内酯共聚物(P(LLA-co-CL))作为软骨组织工程支架材料的可能性及与AMSCs复合体外构建组织工程化软骨的可能性及方法。方法制备P(LLA-co-CL)支架,将细胞接种于支架,分为IGF组、TGF组、IGF+TGF组及对照组,根据分组不同分别加入不同的软骨诱导剂或培养基,2周后取出支架采用电镜扫描,观察细胞在材料表面生长增殖情况。将复合物切片,进行HE染色、甲苯胺兰染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色。RT-PCR检测各组复合物内表达Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan及Sox9 mRNA的情况;Western blot检测各组Ⅱ型胶原蛋白和aggrecan的表达。结果接种后,细胞悬液迅速进入支架。电镜扫描见细胞黏附于材料表面生长。HE染色显示三个诱导组有大量细胞存在,未诱导组细胞较稀少。甲苯胺兰染色显示三个诱导组细胞及细胞外基质蓝色异染,对照组细胞阴性着色。Ⅱ型胶原蛋白免疫组化染色显示三个诱导组细胞及细胞外基质棕黄色着色,对照组细胞阴性着色。RT-PCR检测显示IGF组及TGF组表达Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan及Sox9 mRNA显著高于对照组,IGF+TGF组表达Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan及Sox9 mRNA明显高于IGF组和TGF组。Western blot检测显示IGF组及TGF组表达Ⅱ型胶原蛋白及aggrecan显著高于对照组,IGF+TGF组表达Ⅱ型胶原蛋白及aggrecan明显高于IGF组和TGF组。结论P(LLA-co-CL)支架可以为AMSCs提供粘附生长、向软骨细胞分化及合成和分泌细胞外基质的场所。IGF-1可以单独诱导三维立体状态的AMSCs向软骨细胞分化,并和TGF-β1有协同作用。第四章IGF-1诱导的AMSCs复合P(LLA-co-CL)支架体内软骨形成目的探讨诱导后AMSCs复合P(LLA-co-CL)支架体内成软骨能力,以及IGF-1与TGF-β1的协同诱导作用对体内构建软骨组织的影响。方法将AMSCs接种于P(LLA-co-CL)支架,分为IGF组、TGF组、IGF+TGF组及对照组,根据分组不同分别加入含IGF-1或(和)TGF-β1的无胰岛素软骨诱导剂或培养基。2周后取出复合物,植入裸鼠皮下,观察裸鼠活动情况及切口情况。2个月后取出复合物,切片进行HE染色、Ⅱ型胶原蛋白免疫组化染色及甲苯胺兰染色,观察各组高硫酸化的蛋白聚糖和Ⅱ型胶原着色情况。Western blot检测各组复合物内Ⅱ型胶原蛋白和aggrecan的表达。结果植入裸鼠皮下后,裸鼠进食良好,活动正常,切口一期愈合。2个月后获取复合物,IGF+TGF组复合物的直径明显大于IGF组和TGF组。HE染色结果显示三个诱导组复合物内均有软骨陷窝形成,而对照组未见软骨陷窝形成。甲苯胺兰染色显示三个诱导组基质蓝色异染,而对照组阴性着色。Ⅱ型胶原蛋白免疫组化染色显示三个诱导组中细胞外基质呈棕黄色着色,而对照组阴性着色。Western blot检测显示IGF+TGF组合成Ⅱ型胶原及aggrecan明显多于TGF组和IGF组,而TGF组和IGF组无显著性差异。结论IGF-1诱导的人AMSCs具备体内成软骨能力。IGF-1和TGF-β1联合应用有助于构建高质量软骨组织。P(LLA-co-CL)支架具有可吸收性,能够作为构建组织工程化软骨的支架材料。