纤维素是地球上丰富的可再生资源,其发酵生产的生物质燃料对解决目前能源问题具有十分重要意义。然而纤维素酶水解效率较低,极大地限制了纤维素在酶解发酵方面的高效应用。近年许多研究发现,溶解性多糖单加氧酶家族Auxiliary Activity 9（AA9）对纤维素的水解具有明显促进作用,这为AA9作为纤维素酶辅助酶用于纤维素高效水解提供了一种可能。基于此,本文尝试开展辅助酶AA9的构建表达和应用于纤维素水解的研究,主要研究内容如下:论文首先通过密码子优化和抗性筛选,获得两株异源表达AA9的单质粒重组毕赤酵母菌株P.pastoris/pPIC9K-gh61和P.pastoris/pPICZαA-gh61;通过进一步优化,获得双质粒整合重组菌株P.pastoris GS115-D-gh61,其表达量提高20%。实验考察AA9的酶学性质发现其最适反应温度为60℃,最适反应pH 6.0,5 mmol.L^-1的Co²⁺、Ba²⁺和Cu²⁺对酶活促进作用最明显（分别提高39%、51%和19%）。接着,实验分别对三株重组菌的培养基成分和发酵条件进行优化。其中,通过摇瓶发酵和正交试验,实验获得双质粒整合重组菌株的最适发酵条件为pH 6.0,甲醇补加量1%,转接量3%,PEG 4000 2 g·L^-1,在最适发酵条件下双质粒整合重组菌株的酶活产量能达到0.58 U·L^-1,相对于未优化时提高约1倍。P.pastoris GS115-D-gh61双质粒整合重组菌株进一步进行5 L发酵罐放大培养,培养188 h后细胞密度OD₆₀₀达到490,酶活达到2.28 U·L^-1。最后,论文开展重组酶AA9应用于木质纤维素酶解的初步探索。采用标准底物时,羧甲基纤维素钠水解过程中添加AA9没有作用,但微晶纤维素酶解时添加AA9(1 mg·g^-1干基)可使酶解率提高1倍以上,滤纸酶解过程中添加AA9(0.75 mg·g^-1干基)其酶解率提高40.6%。采用天然底物时,碱催化甘油有机溶剂预处理甘蔗渣酶解时添加AA9(1mg·g^-1干基),其酶解率提高21.3%;酸催化甘油有机预处理甘蔗渣在添加AA9(0.5 mg·g^-1干基)时其酶解率提高27.3%。进一步地,实验发现一些金属离子和还原剂可以强化AA9辅助纤维素酶水解效果:添加Co²⁺(2 mmol·L^-1干基)和L-抗坏血酸(1 mg·g^-1干基)时AA9可使碱催化甘油有机溶剂预处理基质的酶解率分别提高41.7%和41.5%;添加Cu²⁺(0.5 mmol·L^-1)和L-抗坏血酸(1 mg·g^-1干基)时AA9可使酸催化甘油有机溶剂预处理基质的酶解率分别提高45.0%和40.5%。采用AA9蛋白替代微量纤维素酶蛋白的酶解实验发现:碱催化甘油有机溶剂预处理基质酶解时添加AA9可使纤维素酶用量节约30%,同样地,酸催化甘油有机溶剂预处理基质酶解时添加AA9可使纤维素酶节约17%。实验所产重组酶蛋白AA9能明显促进木质纤维素类基质的糖化水解,在目前的酶基生物炼制产业具有应用潜力。