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动脉粥样硬化是一种慢性进行性的内皮损伤和炎症反应引起的血管内膜病变。其中斑块破裂后脱落栓子及随后的血栓形成是引起急性心脑血管缺血性卒中的主要原因,而斑块破裂几乎均发生在易损斑块的基础之上。因此,稳定易损斑块是防治动脉粥样硬化及其并发症发生的前提和基础。易损斑块中,纤维帽的完整性及对破裂的抵抗能力主要依靠细胞外基质合成与降解的动态平衡。基质金属蛋白酶和金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP)在维持这一平衡上发挥重要作用。与动脉粥样硬化有关的主要是TIMP1。转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGFβ1)可促进细胞外基质的合成与分泌,调节基质金属蛋白酶的含量与活性,刺激TIMP的合成,在保持粥样斑块炎症和纤维化之间的平衡中起关键作用。是动脉粥样硬化始发的保护因素,同时也是维持斑块稳定性的重要因素。本实验采用氧化铁纳米粒将TGFβ1和TIMP1两种目的质粒进行包裹,在超声靶向微泡破坏(ultrasound targeted microbubble destruction,UTMD)的作用下,携载目的质粒的纳米粒成功转入动脉粥样硬化易损斑块内部,到达细胞外基质,阻断细胞外基质的降解,促进细胞外基质的合成,达到稳定易损斑块的治疗目的。本研究主要分为三个章节:第一章 目的质粒的构建与功能验证目的:构建靶向巨噬细胞的pSNAV2.0-TGFβ1-TIMP1重组腺病毒表达载体,并验证目的质粒的功能,为后期转染实验准备材料。方法:从目的基因的引物合成到扩增,再到重组腺病毒表达载体的构建及测序。进行细胞培养,质粒提取,细胞转染,倒置荧光显微镜观察重组腺病毒转染HEK293细胞的表达情况,qRT-PCR技术和Western-Blot技术分别检测TGFβ1和TIMP1的表达情况。结果:qRT-PCR技术检测结果显示,TGFβ1的表达含量为7.17%±0.15%,明显高于对照组(2.62%±0.47%)和空载组(2.38%±0.33%);TIMP1的表达含量为4.84%±0.15%,明显高于对照组(1.98%±0.06%)和空载组(2.27%±0.08%)。Western-Blot技术检测结果显示,TGFβ1过表达组的灰度值为11946.175,明显高于对照组(3882.841)和空载组(4488.205);TIMP1过表达组的灰度值为15241.338,明显高于对照组(5610.619)和空载组(5579.690)。说明目的质粒构建成功。结论:本实验目的质粒构建成功,可用于后期转染实验。第二章UTMD联合纳米粒促进载TGFβ1-TIMP1质粒转染巨噬细胞的实验研究目的:UTMD联合氧化铁纳米粒进行体外基因转染实验,通过检测转染率及目的基因的治疗效果评估UTMD联合纳米粒促进细胞内基因转染的可行性。方法:制备靶向巨噬细胞的氧化铁纳米粒,细胞实验分为3组:A组为对照组,B组为质粒+纳米粒组,C组为UTMD+质粒+纳米粒组。选择最佳超声辐照条件,分组进行基因转染实验。转染后48小时,通过流式细胞仪检测转染率及细胞凋亡率,并通过Western-Blot及qRT-PCR技术检测目的基因的治疗效果;通过CCK-8细胞毒性实验检测该技术对细胞活性的影响。结果:本实验采用UTMD联合氧化铁纳米粒共同促进目的质粒转染,实验组转染率最高,约为质粒+纳米粒组的1.8倍;实验组的凋亡率最高,约为质粒+纳米粒组的8倍。qRT-PCR结果显示,TGFβ1的表达含量为26.77%±3.67%,明显高于对照组(9.58%±0.75%)和空载组(8.75%±0.63%);TIMP1的表达含量为19.82%±1.23%,明显高于对照组(6.23%±1.01%)和空载组(6.28%±0.59%)。Western-Blot技术检测结果显示,C组TGFβ1的灰度值为19944.794,明显高于A 组(2722.548)和 B 组(2811.669);C 组 TIMP1 的灰度值为 22625.167,明显高于A组(5116.447)和B组(5955.539)。CCK8实验显示对照组细胞存活率最高为0.977±0.005,实验组最低为0.976±0.004,各组间无明显差异,显示UTMD技术与纳米粒对细胞的活性均无明显影响。说明该技术安全可行。结论:UTMD联合纳米粒促进载TGFβ1-TIMP1质粒转染巨噬细胞,明显诱导体外巨噬细胞凋亡,抑制易损斑块的生长,该实验可望为动脉粥样硬化易损斑块的基因治疗提供实验基础。第三章UTMD联合纳米粒促进载TGFβ1-TIMP1质粒转染动脉粥样硬化易损斑块的实验研究目的:UTMD联合纳米粒介导目的质粒转染兔腹主动脉粥样硬化易损斑块,通过检测靶基因分子水平改变、腹主动脉易损斑块超微结构等评估体内基因转染效果,评价该基因传递方法促进体内基因转染的可行性。方法:建立兔腹主动脉粥样硬化易损斑块模型,实验分组:A组:正常健康组;B组:模型组;C组:质粒+纳米粒组;D组:UTMD+质粒+纳米粒组;E组:UTMD+质粒+纳米粒+磁场组。实验处理前及实验处理后10周对兔腹主动脉易损斑块进行常规超声及超声造影分析评估。并通过Western-Blot技术检测目的基因的治疗效果。对兔腹主动脉易损斑块进行HE染色,使用图象分析系统测量每张切片中兔腹主动脉平均内膜厚度(IT)、中膜厚度(MT),斑块厚度(PT),计算内膜/中膜厚度比值(IT/MT)和斑块/内膜厚度比值(PT/IT)。结果:术后第10周,二维高频超声显示各实验组腹主动脉内-中膜回声增强,以B组增厚最为明显,血流信号可见部分充盈缺损,C组、D组、E组腹主动脉内-中膜厚度与A组、B组相比降低,有统计学意义。易损斑块增大,以B组最为明显,C组、D组腹主动脉易损斑块增大,但增幅较B组减小,E组易损斑块增大不明显。第10周各组腹主动脉易损斑块处PSV1及其与上游PSV2相比,各组间无明显差异。超声造影显示,外加磁场后,血管内部的造影剂向血管壁运输增加。结论:UTMD联合纳米粒促进重组目的质粒的靶向转染,明显诱导动脉粥样硬化易损斑块巨噬细胞凋亡,有效抑制易损斑块的生长,该方法可以有效促进体内基因转染。