心肌梗塞（心梗）后重构包括心肌细胞重构和细胞外间质,尤其是Ⅰ、Ⅲ型胶原的重构。心梗的预后与心功能有很大的关系,而心功能与心脏重构有重要关系,后者除了与心肌细胞坏死而导致细胞数量减少有关外,与心肌细胞凋亡及间质纤维化关系密切。心肌梗塞后可发生一系列神经内分泌反应,包括交感神经、肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）以及一系列内分泌激素的释放。近年的研究认为,这些神经内分泌反应可能与梗塞区心肌细胞肥厚、成纤维细胞增生、胶原沉积及细胞凋亡的过程密切相关。严重缺氧导致细胞坏死,而轻度缺氧可促进细胞凋亡。由于心脏间质纤维化导致毛细血管的密度低,而氧的弥散距离和心肌乳酸脱氢酶的活性相应增加,因而,在心脏间质中胶原蛋白所包围的心肌细胞处于缺氧状态,这就意味着心肌细胞凋亡可能伴随着间质纤维化而存在于心肌梗塞的早期和晚期。大多数研究支持心梗后RAAS激活及炎性因子（TNF-α等）增加以及二者的相互作用可能是梗塞部位纤维化及梗塞边缘区细胞凋亡的重要原因之一,但它们对非梗塞区域的心肌也可能产生影响。由于非梗塞区心肌毕竟占整个心脏的大部分,因此这部分心肌的变化过程可能对心梗后心脏重构及心律失常的发生也有重要影响。目前国内对非梗塞部位心肌间质纤维化和细胞凋亡的研究以及阻断RAAS对其影响的研究尚少,且结果仍存在分歧。由于心梗后心脏不同部位、不同阶段发生重构的刺激因素和变化情况可能有所不同,而不同的肾素血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）对心肌组织的亲和力也可能不同,雷米普利是一种长效高组织亲和力的ACEI,故本实验重点研究梗塞后不同阶段非梗塞区心肌间质胶原及细胞凋亡的变化情况及应用雷米普利干预的结果。1.大鼠心梗模型的制备及随机分组:体重250-300克雌性Wistar大鼠（中国医科大学实验动物部提供）,随机分为心梗组（100只）、药物组（100只）及假手术组（50只）。10%水合氯醛0.3ml/100g腹腔内注射麻醉后仰卧固定,胸部备皮。于左侧胸腔第四肋间逐层开胸,迅速打开心包后用左手拇指、食指和中指轻轻挤压右侧胸壁,使心脏暴露于胸腔外,用6-0号丝线弯针在左心耳和肺动脉圆锥之间,距主动脉根部约2-3毫米处穿线,结扎左冠状动脉前降支,观察到供血区域心肌变白、运动减弱,并以标准肢体导联Ⅱ导（纸速25mm/s）心电图ST段抬高,即为入选模型。迅速将心脏放回正常位置,并逐层缝合胸腔,同时在切口处放置一胶管并与20ml注射器相连接,以抽吸胸腔积气和积液,直至大鼠恢复自主呼吸后缝合皮肤。假手术组只挂线而不结扎冠状动脉,余同前。保温待大鼠清醒后,给予水和标准饲料分笼饲养。术后3小时各组存活的大鼠:（1）心梗组（n=53）;（2）药物组（n=48）;假手术组（n=48）。将药物配制成药液（雷米普利1mg/kg/d,溶于1ml自来水中）,于术后3小时及每日上午直接灌胃给药,心梗组及假手术组均喂等量自来水。2.实验动物处死和心脏标本的保存:术后24h、1周、2周及4周随机从各组中各取10-12只大鼠,称量体重后经股静脉注入2～3ml 10%氯化钾,使心室停搏于舒张期,迅速开胸切取心脏,用预冷生理盐水冲洗,去除心房、大血管及心脏外结缔组织等,留取左心室（包括室间隔）,称量左室重量（LVAW）,与体重相除,得出左室相对重量（LVRW）。用直接测量法测量左心室长轴长度（L）。在长轴中点处垂直于长轴将左室一分为二,心尖侧一半心肌组织于4%多聚甲醛溶液中固定保存24小时后,经石蜡包埋,连续行5μm厚的切片行病理组织学检查、心肌胶原容积密度分数（CVF）测定,以及肿瘤坏死因子α（TNF-α）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、caspase-3的免疫组化染色研究和凋亡细胞的TUNEL标记检测。切取左室近心底部非梗塞区心肌组织分别用于透射电镜（心肌组织于2.5%戊二醛溶液中固定）、血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）和醛固酮（ALd）含量及Ⅰ、Ⅲ型胶原和凋亡基因Bcl-2及p53的mRNA检测（心肌组织用锡纸包存,立即液氮速冻后-70℃冻存）。3.心肌石蜡切片HE染色及梗塞范围测定:每个大鼠按顺序取第二张5μm石蜡切片,常规HE染色过程染色,在放大10倍下获取包括整个左室截面的切片图象,用计算机图像分析系统测定每张切片上左室截面最长径（Dmax）、最短径（Dmin）、瘢痕弧长以及心内、外膜周长,计算左室截面直径D（即短轴直径）=（Dmax×Dmin）^1/2,球形指数=心室长轴长度（L）/短轴直径（D）,梗塞范围（%）=瘢痕弧长/[（外周长+内周长）/2]×100%。取梗塞范围大于20%标本进入研究队列。4.透射电镜标本制备:取冻存的心肌组织约1 mm³,2.5%戊二醛固定2小时,PBS冲洗3次,1%O_sO₄（锇酸）固定2小时,PBS冲洗后经系列酒精、丙酮脱水,Epon-812环氧树脂包埋,35℃、45℃、60℃加热聚合。LKB-V（NOVA）型超薄切片机切片,醋酸双氧铀柠檬酸铅重金属染色,H-600-TEM透射电镜观察和拍照实验结果。5.原位末端标记（TUNEL）法标记凋亡心肌细胞:每一标本取三个不同部位石蜡切片,常规脱腊入水。新鲜配制3%H₂O₂,室温处理10分钟后蒸馏水洗涤2分钟×3次。标本片加0.01 M TBS 1:200新鲜稀释Proteinase K37℃消化10分钟,0.01M TBS洗2分钟×3次后加标记缓冲液（LabelingBuffer）20μL/片,以保持切片湿润。按每张切片取TdT和DIG-d-UTP各1μL,加入18μL标记缓冲液中,混匀。甩去切片上多余液体后加标记液,20μL/片。置样品于湿盒中,37℃标记2小时。0.01M TBS洗2分钟×3次后加封闭液50μL/片,室温30分钟,甩掉封闭液,不洗。用抗体稀释液1:100稀释生物素化抗地高辛抗体（取1ml抗体稀释液加生物素化抗地高辛抗体10μL）,混匀后50μL/片加至标本上。置样品于湿盒中,37℃反应30分钟。0.01M TBS洗2分钟×3次后用抗体稀释液1:100稀释SABC（取1ml抗体稀释液加SABC10μL）,混匀后50μL/片加至切片。37℃反应30分钟。0.01M TBS洗5分钟×4次。取1ml蒸馏水,分别加入DAB试剂盒中A,B,C试剂各一滴,混匀后加至标本上,显色20分钟左右。水洗后苏木素轻度复染。0.01M TBS洗,蒸馏水洗。脱水,透明,封片。凋亡细胞半定量分析:每张切片在放大400倍下从非梗塞区获取切片图象,记数每张切片凋亡阳性细胞数目占总心肌细胞数目的比例,计算凋亡细胞指数。6.心肌胶原容积密度分数（CVF）测定（Messon三色法）:切片脱蜡后蒸馏水洗。3%重铬酸钾过夜,天青石兰B染10分钟,苏木精液染10分钟,1%盐酸酒精分化,细胞核变蓝。酸性复红。丽春红G。橙黄G稀释液染10分钟。滤纸轻吸。5%磷钨酸分化20分钟。亮绿染色15分钟,迅速通过95%酒精。脱水、封片如常。半定量分析:每张Messon染色切片在放大400倍下从非梗塞区获取切片图象,随机选取4个视野,通过测量选定区域染色组织的面积,将测量的面积与观察下的整个面积的比例来作为每个视野中胶原组织占百分比。富含胶原的血管边界区域不包括在测量范围内。最后取均数代表胶原容积分数（CVF）。7.TNF-α、MMP-9及caspase-3免疫组织化学染色（SP法）:石蜡切片常规脱蜡至水。3%H₂O₂去离子水孵育10分钟后,蒸馏水冲洗,PBS浸泡5分钟。取一定量PH=6.0柠檬酸盐缓冲液于烧杯中,放在电炉上加热直至沸腾;将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上,放入已沸腾的缓冲液中,继续煮20分钟;烧杯离开火源冷却至室温,从缓冲液中取出玻片,先用蒸馏水冲洗两次,之后用PBS（PH=7.3）冲洗2×3分钟。滴加正常山羊血清工作液（蓝色液体）室温孵育20分钟,倾去。滴加适当比例稀释的一抗,37℃孵育2小时。PBS冲洗3×3分钟。滴加生物素化二抗工作液（IgG/Bio）（黄色液体）,37℃孵育20分钟。PBS冲洗3×3分钟后,滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液（S-A/HRP）（橙色液体）,37℃孵育20分钟。PBS冲洗3×3分钟后DAB显色5分钟。自来水充分冲洗。封片。阳性反应产物强度灰度值测定:每个大鼠取一张切片,在放大400倍获取非梗塞区切片图象,每张切片随机选取4个视野,各组免疫组织化学阳性反应产物强度用图像分析系统灰度值（灰度值与阳性反应产物强度呈反比）表示,取均数代表其表达强度。8.AngⅡ及ALd含量检测:称取左室非梗塞区心肌100mg剪碎,加入AngⅡ试剂盒中缓冲液0.6ml,在冰浴中进行超声匀浆,匀浆液在4℃下以3000rpm离心20分钟,取上清液原液及稀释10倍后液体,分别测定ALd及AngⅡ含量,严格按试剂盒说明书操作。9.逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）测定Ⅰ、Ⅲ型胶原和凋亡基因Bcl-2及p53的mRNA表达:采用Trizol一步法提取心肌标本中的总RNA,按RT-PCR试剂盒步骤完成逆转录PCR反应。col-1:上游引物:5′-CA-GATTGAGA ACATCCGCAGC,下游引物:TCTAGCTCGAGTCCCCGC-5′,扩增条件为50℃,30min;84℃,0.5min,55℃,0.5min,72℃,5min;反复30个循环,产物为481bp。Col-3:上游引物:5′-AGGATCTGAGGGCTCGCC,下游引物:AGTTCTCGCCTCTTATGACCC-5′,扩增条件为50℃,30min;84℃,0.5min,54℃,0.5min,72℃,5min;反复30个循环,产物为314bp。p53:上游引物:5′-GACCGTCGGACAGAGGAAGA,下游引物:GTAGTGGTCGGAGGGGC-5′,扩增条件为50℃,30min;84℃,0.5min,54℃,0.5min,72℃,5min;反复30个循环,产物为379bp。Bcl-2:上游引物:5′-TGGTGGACAA-CATCGCTCTG,下游引物:CGTTTACCAGTTTAGTCGATAAATG-5′,扩增条件为50℃,30min;84℃,0.5min,54℃,0.5min,72℃,5min;反复30个循环,产物为412bp。β-actin:上游引物:5′-TGTGCTATGTTGCCCTAGACTTC,下游引物:TCGTCCTCATGCTACTCAGGC-5′,产物为450bp。取8μl PCR反应产物,于2%琼脂糖凝胶电泳后经凝胶成像系统分析处理,分别计算col-1、col-3、Bcl-2及p53的mRNA与β-actin的mRNA的灰度值比值。10.统计学处理:所有数据以均数±标准差（（?）±s）表示,数据应用SPSS 11.5软件包单因素ANOVA（方差分析）方法进行差异显著性检验,P<0.05有统计学意义。结果1.大鼠一般情况:术后存活的149只大鼠,在随后4周的干预期内共死亡22只,死亡率14.8%。其中24小时内死亡15只（心梗组10只,药物组4只,假手术组1只）;术后1周死亡6只（心梗组4只,药物组2只）;术后2周死亡1只（为心梗组）。其中死于心衰8只,不明原因14只。最终假手术组存活47只,心梗组存活32只,药物组存活37只。2.心肌组织病理学改变:心梗组和药物组共计69只大鼠,经左冠状动脉永久性结扎后形成左室前壁透壁性心肌梗塞,梗塞范围为23～35%。心肌组织24h HE染色显示梗塞区心肌纤维溶解断裂,细胞淡染,可见大量白细胞浸润;假手术组表现为心肌细胞排列整齐,无炎性细胞浸润。3.左室形态结构改变:以左室绝对重量（LVAW）、左室相对重量（LVRW）、左室截面直径和球形指数代表左室重塑指标。三组比较,术后24h,LVAW、LVRW、左室截面直径和球形指数尚无统计学差异（P>0.05）;手术1W后,心梗组与假手术组比较,LVAW、LVRW、左室截面直径增大,球形指数缩小,2W～4W最明显,组间有显著统计学意义（p<0.05～0.001）,用雷米普利2W后,上述指标有所改善,4W明显改善（p<0.05）。4.非梗塞区心肌CVF的变化:心肌组织Messon染色显示,假手术组间质只可见散在亮绿色胶原;术后24h～1W,心梗组和药物组间质亮绿色胶原与假手术组基本相似;2w时心梗组间质亮绿色胶原增多;4W时心梗组间质亮绿色胶原明显增多,而药物组间质亮绿色胶原明显减少。半定量分析发现,心梗组非梗塞区CVF随着梗塞后时间的延长而增加,2W～4W最明显（P<0.05～0.01）;而用雷米普利2W左右开始下降,4W明显下降（P<0.05）,但仍然高于假手术组（P<0.05）。5.非梗塞区心肌细胞的凋亡:TUNEL染色可见,假手术组大鼠及术后24h心梗组和药物组大鼠非梗塞区未见凋亡心肌细胞;术后1W～4W心梗组和药物组大鼠心肌组织均分布有TUNEL染色阳性心肌细胞,核呈棕黄色,染色深浅不一,核大小不一。半定量分析显示,术后1W～4W凋亡细胞指数逐渐升高;与心梗组比较,术后4W药物组凋亡细胞指数明显下降（p<0.05）。6.非梗塞区心肌超微结构:透射电镜可见假手术组心肌细胞核膜完整,核质分布均匀,染色较淡,呈细粒分散状,胞浆内线粒体膜完整,嵴清楚;术后2W～4W心梗组及药物组有的心肌细胞核收缩,染色质缩合成块状,有的线粒体轻度肿胀、部分空泡化。术后2W～4W时心梗组心肌间质成纤维细胞增多,间质胶原纤维明显增多,呈束状或相互交织排列;术后4W时药物组心肌间质胶原纤维明显减少。7.非梗塞区心肌TNF-α的变化:假手术组心肌间质只有散在染色极浅的弱阳性反应。术后1W～4W,心梗组心肌间质可见明显TNF-α表达。术后2W～4W,药物组TNF-α表达略少于心梗组。灰度值分析显示,假手术组心肌TNF-α表达水平极低,心梗组心肌TNF-α的表达在梗死后1W开始增强（p<0.05）,2W～4W显著增强,与假手术组比较差异显著（p<0.01）;而药物组在梗塞后2W～4W的TNF-α表达水平明显低于相应时间心梗组的水平（p<0.05）。8.非梗塞区心肌MMP-9的变化:术后24h～4W,心梗组和药物组MMP-9表达与假手术组比较均无增强。灰度值分析显示,术后24h～1W2组MMP-9水平与假手术组比较无差异,而术后2W～4W虽然有下降趋势,但也无统计学意义（p>0.05）。9.非梗塞区心肌caspase-3的变化:假手术组可见散在分布的心肌细胞,其胞浆具有染成棕黄色的caspase-3产物。术后24h～1W,心梗组和药物组具有caspase-3阳性染色产物的心肌细胞与假手术组相似,免疫组织化学染色灰度值与假手术组无统计学差异（p>0.05）;术后2W～4W,2组具有caspase-3阳性染色产物的心肌细胞数量增多,颜色增浓,免疫组织化学染色灰度值明显降低,与假手术组比较有统计学意义（p<0.05）,但药物组与心梗组间无差异。10.非梗塞区心肌AngⅡ及ALD的变化:术后24h,除了心梗组AngⅡ水平略有升高外,各组AngⅡ及ALD水平相似（p>0.05）;术后1W～4W,与假手术组比较,心梗组AngⅡ水平逐渐升高（p<0.05～0.001）,术后2W,心梗组ALD也开始明显升高（p<0.05～0.001）;用药后2W时AngⅡ明显回落（p<0.05）,但继续用药至4W时,AngⅡ水平仍然很高,且与心梗组比较没有回降（p>0.05）,而ALD水平明显低于心梗组（p<0.05）,但仍高于假手术组（p<0.05）。11.非梗塞区心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原（col-1、col-3）的变化:以β-actin为内参对照,结果以Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA与β-actin mRNA灰度值的比值表示。结果显示,术后24h,三组间Ⅰ、Ⅲ型胶原含量相似;术后1W～4W,心梗组col-3均明显高于假手术组（p<0.05）,但4W时略有下降趋势,而用药后1W～4W均未见明显下降（P>0.05）;术后2W～4W,心梗组col-1明显上升,4W更明显（p<0.05～0.01）,用药4W时col-1明显回降（p<0.05）,但仍高于假手术组（p<0.05）。12.非梗塞区心肌凋亡基因p53及Bcl-2的变化:以β-actin为内参对照,结果以p53及Bcl-2 mRNA与β-actin mRNA灰度值的比值表示。结果显示,术后24h,三组间p53及Bcl-2 mRNA无明显区别,1W～4W时,心梗组p53明显上升（p<0.05～0.01）,Bcl-2明显下降（p<0.05～0.01）,尤其4W时更明显;药物组p53及Bcl-2虽然分别有下降和上升趋势,但均无统计学意义（p>0.05）。结论1.大鼠心肌梗塞后1周即发生了左室重构,早期持续使用雷米普利对左室重构有逆转作用。2.大鼠心梗2周后非梗塞区出现间质纤维化,可能与局部RAAS激活后增加AngⅡ水平及TNF-α上调有关。3.大鼠心梗2周后非梗塞区发生细胞凋亡改变,可能与局部RAAS激活增加AngⅡ水平、TNF-α上调、caspase-3激活、p53上调、Bcl-2下调及间质胶原过度沉积有关。4.雷米普利可能通过降低AngⅡ水平及抑制TNF-α表达而抑制间质纤维化和细胞凋亡,减轻间质胶原的沉积而抑制细胞凋亡也可能是其抗凋亡机制之一。