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CXC Chemokine Receptor 3——CXCR3(CD183)是一种七次跨膜的G-蛋白偶联受体,主要表达于活化/记忆T细胞、NK细胞及巨噬细胞等表面。Loetscher等于1996年首次从人CD4+ T细胞来源的cDNA文库中克隆出人CXCR3基因,基因编码区长度为1104bp,编码368个氨基酸,蛋白分子量为40.659 kD。目前已发现三种剪接变体,分别为CXCR3-A(即通常所说的CXCR3)、CXCR3-B及CXCR3-alt;有三种CXC趋化因子配体与可之结合,分别为CXCL9/Mig、CXCL10/IP-10及CXCL11/I-TAC。近年研究发现,CXCR3在一些恶性肿瘤细胞表面高表达,通过受体-配体相互作用介导肿瘤的转移和侵袭。因此,本研究旨在克隆人和小鼠CXCR3基因,建立稳定表达人/小鼠CXCR3分子的基因转染细胞株L929-huCXCR3和L929-mCXCR3,研究L929-huCXCR3和L929-mCXCR3在CXCR3配体作用下的迁移能力。以L929-huCXCR3作为免疫原和筛选细胞,建立能持续分泌鼠抗人CXCR3单克隆抗体的杂交瘤细胞株;以单克隆抗体作为工具,研究CXCR3信号通路对肿瘤转移和生长的影响。第一部分人及小鼠CXCR3基因转染细胞株的构建及鉴定【目的】克隆人及小鼠CXCR3编码区全长基因,获得稳定表达人/小鼠CXCR3膜型分子的基因转染细胞株L929-huCXCR3和L929-mCXCR3 ;研究L929-huCXCR3和L929-mCXCR3在CXCR3配体介导下的迁移效应。【方法】采用RT-PCR方法从活化的人外周血T淋巴细胞中扩增人CXCR3基因;同样方法从经Con A体内刺激、IL-2体外诱导培养的小鼠脾脏和胸腺细胞扩增小鼠CXCR3基因,分别插入逆转录病毒载体pEGZ-term。将重组逆转录病毒载体pEGZ-term/huCXCR3和pEGZ-term/mCXCR3分别与两辅助病毒载体脂质体法共转染包装细胞293T,收集含完整逆转录病毒颗粒的293T培养上清,用其感染L929细胞,重复感染3次,经Zeocin加压筛选获得稳定表达人/小鼠CXCR3分子的基因转染细胞株L929-huCXCR3和L929-mCXCR3。采用免疫荧光和RT-PCR方法对L929-huCXCR3和L929-mCXCR3细胞进行鉴定;应用Transwell隔离小室系统研究基因转染细胞株在Mig、IP-10及I-TAC作用下的迁移效应。【结果】获得了稳定表达人/小鼠CXCR3膜型分子的基因转染细胞株L929-huCXCR3和L929-mCXCR3,两种细胞内GFP和膜表面人/小鼠CXCR3分子的阳性表达率均在95.0%以上。L929-huCXCR3在人CXCR3配体的作用下可发生定向迁移,但所需的起始浓度不同、同等浓度下三种配体介导的迁移率也不同;L929-mCXCR3在50 ng/mL小鼠IP-10的作用下可发生定向迁移,并且抗小鼠CXCR3抗体对L929-mCXCR3的迁移具有抑制作用。【结论】人及小鼠CXCR3基因转染细胞株L929-huCXCR3和L929-mCXCR3的建立,为研究CXCR3信号转导的生物学功能、肿瘤转移模型的建立及抗人/小鼠CXCR3单克隆抗体的研制奠定了理论和物质基础。第二部分鼠抗人CXCR3单克隆抗体的研制及生物学功能研究【目的】获得持续分泌鼠抗人CXCR3单克隆抗体的杂交瘤细胞株;以鼠抗人CXCR3单克隆抗体作为工具,研究人CXCR3分子的表达特性及CXCR3信号转导对L929-huCXCR3和结肠癌细胞株的迁移及增殖的影响。【方法】以高表达人CXCR3膜型分子的L929-huCXCR3细胞作为免疫原免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交技术,将免疫小鼠的脾脏细胞与同种系小鼠的骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。以L929-huCXCR3作为筛选细胞,转染空载体的L929-mock细胞作为阴性对照细胞,采用间接免疫荧光和流式细胞术,筛选能持续分泌抗人CXCR3单克隆抗体的杂交瘤细胞株。采用细胞核染色体计数、Ig亚类快速定性试纸法、间接免疫荧光以及Western blot对所获得的杂交瘤细胞株和单抗进行鉴定。用间接免疫荧光法分析CXCR3分子在肿瘤细胞表面的表达;Transwell隔离小室检测单抗对L929-huCXCR3和结肠癌细胞株Colo205、HCT116及HT29迁移的影响;MTT法分析单抗对结肠癌细胞株Colo205增殖的影响。【结果】获得了1株能持续分泌鼠抗人CXCR3单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为9B5。经快速定性试纸分析显示,该单抗重链为IgG1亚类,轻链为κ链;间接免疫荧光和流式细胞术分析显示,单抗9B5可识别活化T淋巴细胞和结肠癌细胞株Colo205、HCT116及HT-29表面的CXCR3分子,并且可用于Western blot检测。通过阻断CXCR3信号转导,单抗9B5可抑制L929-huCXCR3细胞和结肠癌细胞株Colo205、HCT116和HT29的定向迁移及IP-10对Colo205的促增殖作用。【结论】成功获得了1株能持续分泌鼠抗人CXCR3单克隆抗体的杂交瘤细胞株,为研究CXCR3的表达特性及深入探讨CXCR3信号转导在肿瘤生长与转移过程中的作用及机制奠定了物质基础,并且有望为治疗肿瘤转移提供新的思路和新型药物。