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人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus HPV)能够引起肛生殖器部位的多种良性及恶性病变。在HPV感染所致疾病中,尖锐湿疣是一种相当常见的性传播疾病。虽然该疾病为良性病变,但是具有反复发作,不易痊愈的特点,往往会给患者带来沉重的心理压力及经济负担。尖锐湿疣主要由HPV6及HPV11感染所引起,其中由HPV6感染所引起的占到了70%。因此,一种有效的HPV6疫苗能够显著减少尖锐湿疣的发生和传播。
研究表明HPV L1蛋白在体外组装而成的类病毒颗粒(Virus-Like Particle VLP)是一种良好的HPV疫苗形式,可以诱导高滴度的抗HPV中和抗体。目前,已有两种HPV VLP疫苗上市,其安全性及有效性也得到了充份的证实。但是上述两种疫苗均采用真核表达系统,生产成本高,产品价格昂贵,难以在发展中国家推广。而大肠杆菌表达系统具有培养条件简单,生产成本低廉的突出优点。若将其应用于HPV6 VLP疫苗的研究中将能够降低疫苗成本,促进该疫苗在发展中国家的推广。本研究尝试利用大肠杆菌表达系统制备具有良好免疫原性及稳定的HPV疫苗,并对该疫苗的结构及表位进行分析。
在本研究中并未以包涵体的形式在大肠杆菌中表达重组蛋白HPV6N5C-L1,而是将目的蛋白以非融合的形式可溶地表达于大肠杆菌中。所表达的HPV6N5C-L1蛋白在经过盐析沉淀,复溶,阳离子交换色谱,疏水相互作用色谱这一系列纯化步骤之后,其纯度能够达到96%以上。经纯化的HPV6N5C-L1很好的保持了其天然构象,可以在缓冲液(10mmol/L PB pH6.0,150mmol/L NaCl)中组装为半径约为25nm左右的空心颗粒,具有典型的HPV6 VLP的形态结构。
在上述HPV6VLP小量制备方法基础上,本研究进一步进行了HPV6VLP疫苗的中试研究,以便建立高效,稳定的HPV6 VLP中试工艺。研究结果显示,该工艺不但具有25%左右的较高得率,而且对于目的蛋白具有良好的纯化效果。经过纯化,目的蛋白的纯度能够达到96%以上,而内毒素,外源DNA含量均能够符合药典要求。此外,通过对三批次中试的观察,证实了该工艺同时具有良好的稳定性。
中试研究所制备的HPV6VLP疫苗需要进一步进行免疫原性及稳定性考察。实验结果显示,本研究制备的HPV6 VLP疫苗的ED50为0.009μg,低于对照组中Merck HPV疫苗Gardasil的0.016μg。在稳定性研究中,HPV6 VLP疫苗原液在25℃放置7Day后,其平均水化半径,HPLC保留时间,沉降系数,体外相对抗原含量均未发生明显变化。在37℃放置7天后,HPV6 VLP的平均水化半径有略微增大,而其余检测指标也未见明显变化。上述研究结果证实了本研究所制备的HPV6 VLP具有良好的免疫原性及稳定性。
由于HPV VLP具有复杂的空间构象,而且HPV疫苗的效果也严格依赖于其正确的空间构象的形成。因此本研究在成功制备HPV6 VLP疫苗的基础上进一步对该疫苗的结构及抗原表位进行研究,以阐明HPV6 VLP的结构及表位特征,为建立全面的疫苗质控体系及进行疫苗设计奠定基础。
结构分析显示,组成大肠杆菌来源HPV6 VLP的五聚体在大小,分子量上均与理论值吻合,并且在一定条件下能够形成晶体,具有正确的构象。而HPV6 VLP为空心圆形颗粒,平均约半径为25nm,表面可见壳粒,具有典型的HPV VLP的特征,与真核来源的HPV VLP无异。通过对多个中试批次样品进行分析,可以发现所制备的HPV6VLP在颗粒半径,保留时间,沉降系数等指标上具有高度的一致性。
在表位研究中,本研究筛选得到了HPV6优势中和单抗7A8,13H5,这两株单抗同时还具有HPV6/11交叉中和活性。利用这两株单抗模型与HPV6五聚体模型的分子对接,可以将HPV6的优势中和表位定位于HPV6VLP表面的DE,FG, HI三个环状区域上。而后进一步通过同源扫描的方法验证了上述对接结果,并且进一步将上述表位定位于HPV6VLP表面的三个区域:V138N139V140G141,E259V260G261E262P263V264P265D266 T267L268I269I270, S345T346 Y347T348 N349 S350 D351Y352。
综合上述结果,本研究成功利用大肠杆菌表达系统制备了HPV6 VLP疫苗,验证了其稳定性,有效性及结构正确性,并且对其优势中和表位进行了定位。这些工作将为HPV6疫苗研究及新型HPV疫苗设计提供参考。