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研究背景随着恶性肿瘤发病率的逐渐升高,肿瘤已成为威胁人类健康和生命最主要的疾病之一。据统计报告预测,2015年美国将有1,658,370例新发癌症病例,并有589,430例死亡病例。近年来,中国的乳腺癌发病率呈逐年上升趋势。在女性肿瘤患者中,乳腺癌的发病率居所有肿瘤发病率的第1位,死亡率为第2位。乳腺癌的发生和转移是一个多步骤、多因素的过程,它受到肿瘤本身和宿主免疫功能等因素的影响。近年来,随着对乳腺癌研究的深入,人们越来越认识到宿主的免疫功能在乳腺癌发生、发展过程中发挥重要作用。乳腺癌细胞通过分泌VEGF、PGE2和TGF-p等因子和诱导正常宿主细胞完成免疫抑制功能,故许多肿瘤患者存在免疫功能低下。在被诱导的正常宿主细胞中,血管内皮细胞不仅是血管与周围组织间的物理屏障,还可分泌免疫调节因子,发挥免疫调节功能,因此被认为与肿瘤细胞所诱导的免疫抑制有关,但其具体机制目前尚不清楚。本研究通过研究人和小鼠的乳腺癌细胞诱导血管内皮细胞所分泌免疫因子的变化,旨在探讨乳腺癌细胞对血管内皮细胞的诱导作用和免疫抑制作用及其可能的机制。研究方法乳腺癌细胞(MCF-7)培养24h,收集其培养上清离心后备用。血管内皮细胞(]Human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)生长至70-80%融合后,分别给予1640培养基、VEGF及MCF-7的培养上清和SU5416+MCF-7的培养上清进行刺激24h,随后换用1640培养基培养24h后,收集其上清液(条件培养基)一部分用ELISA法测定血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)、前列腺素E2(Prostaglandin E2, PGE2)、IL-6和IL-12,另一部分刺激外周血T细胞后,进行CCK-8、ELISPOT及流式细胞学实验。30只6～8周龄的雌性BALB/c小鼠随机分成3组,分别行第4对乳腺注射PBS、注射4T1细胞和注射4T1细胞+Celecoxib灌胃,作为PBS组(n=10)、4T1组(n=10)及TC组(n=10),建立小鼠乳腺癌模型。所有小鼠眼球摘除法取血,离心后收集血清,应用ELISA法分别测定PBS组、4T1组和TC组的白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)和白介素-12(IL-12)。PBS组和4T1组的肺组织一部分以(q)RT-PCR和Western blot实验测定环氧合酶-2(COX-2)的表达水平,另一部分分离小鼠肺血管内皮细胞(Mouse pulmonary vascular endothelial cell, MPVEC)并培养,用ELISA法测定培养上清中PGE2的表达水平。研究结果1.乳腺癌细胞诱导血管内皮细胞免疫抑制因子分泌增加ELISA实验表明,经乳腺癌细胞(MCF-7)24h培养上清刺激后,血管内皮细胞(HUVEC) 24h培养上清(T-sup组)中VEGF、PGE2和IL-6表达水平较Media组明显升高。2.乳腺癌细胞诱导血管内皮细胞免疫增强因子分泌减少ELISA实验显示,经MCF-7细胞24h培养上清刺激后,HUVEC细胞24h培养上清(T-sup组)中IL-12表达水平较Media组明显降低。3.乳腺癌细胞诱导血管内皮细胞促进T淋巴细胞凋亡CCK-8实验显示,与对照组比较,以MCF-7细胞诱导后HUVEC细胞条件培养基处理T细胞,24h的O.D.值无明显差异,48h的O.D.值降低,表明T细胞凋亡增加。4.乳腺癌细胞诱导血管内皮细胞抑制T淋巴细胞免疫功能ELISPOT结果显示,以MCF-7细胞诱导后HUVEC细胞条件培养基处理PBMC(主要为T淋巴细胞),T淋巴细胞IFN-y的表达水平降低。5.乳腺癌细胞诱导血管内皮细胞抑制C1)8+T细胞活化流式细胞学实验显示,以MCF-7细胞诱导后HUVEC细胞条件培养基处理T细胞24h,IFN-γγ染色阳性的CD8+T细胞比例较对照组减少,而IFN-7染色阳性的CD4+T细胞比例较对照组无明显差异。6.荷瘤小鼠血液中免疫抑制因子含量增加ELISA结果显示,4T1组与PBS组相比,免疫抑制因子IL-6和IL-10的含量升高。7.荷瘤小鼠血液中免疫增强因子含量减少ELISA结果显示,4T1组与PBS组相比,免疫增强因子IL-12含量降低。8.乳腺癌细胞分泌的VEGF在血管内皮细胞分泌免疫因子中的作用ELISA实验表明,MCF-724h培养上清中VEGF水平较HUVEC中明显升高。VEGF组中VEGF、PGE2和IL-6水平较对照组升高,IL-12水平降低,加入VEGF受体拮抗剂SU5416后,各因子的表达水平与对照组无明显差异。9.荷瘤小鼠肺组织中COX-2和PGE2表达上调(q)RT-PCR和VWestern blot显示,COX-2在4T1组的表达均较PBS组上调。分离的4T1组MPVEC 24h培养上清中,PGE2的水平也较PBS组的表达水平高。10.Celecoxib拮抗乳腺癌细胞诱导血管内皮细胞的免疫抑制作用ELISA结果显示,TC组小鼠给予Celecoxib治疗后,与4T1组相比,血清中免疫抑制因子IL-6和IL-10的含量降低,IL-12含量升高,与PBS组相比无明显统计学差异。结论1.乳腺癌细胞诱导血管内皮细胞免疫功能抑制。2.乳腺癌细胞诱导血管内皮细胞免疫功能抑制可能与VEGF诱导PGE2表达增高有关。