生物免疫治疗是手术、化疗及放疗之外治疗恶性肿瘤的重要辅助手段。肿瘤特异性免疫治疗是根据细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)可以特异性识别存在于肿瘤细胞表面的抗原多肽——这种识别受主要组织相容性抗原复合体(major histocompatibility complex,MHC)-Ⅰ类分子限制,抗原提呈细胞(antigen presenting cell,APC)摄取肿瘤抗原肽,并以MHC-肽分子复合物的形式被呈递于APC表面,CTL可特异性识别该MHC-肽分子复合物,同时被激活,并进一步增生分化,从而特异杀伤肿瘤细胞[1]。T细胞能够识别的抗原是靶细胞或抗原呈递细胞的MHC-Ⅰ类或Ⅱ类分子呈递的由8~12个氨基酸组成的多肽,因此对肿瘤相关抗原的CTL表位肽进行预测并制备其相应的多肽疫苗是十分有意义的。相关抗原肽的CTL表位可以被人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)A2、A3分子递呈,而HLA-A2在我国人群中最为常见,阳性率高达53%[2],因此筛选HLA-A2限制性CTL表位肽具有更大的代表性。HLA-A2限制性CTL表位的鉴定主要经过以下4个步骤[3]:(1)应用多种软件和数据库,从目的抗原中预测出可能的T表细胞表位;(2)合成相应多肽,应用TAP缺陷的T2细胞株,对其进行MHC分子结合力分析;(3)体外实验中使用多肽刺激初始型T细胞;(4)使用表达目的抗原和MHC配型符合的肿瘤细胞作为靶细胞,鉴定效应CTL的活性。目前根据这个技术路线,已从相关肿瘤抗原中鉴定出数十个HLA-A2.1限制性的CTL表位[4-6]。卵巢癌是女性癌症死亡的第五大常见原因,在所有妇科恶性肿瘤中死亡率最高[7]。每年在全世界诊断出超230,000个新病例和151,900个女性死于卵巢癌[8]。主要是由于早期缺乏典型的临床症状、有效的筛选和早期诊断方法来检测疾病。超过75%的患者在诊断时处于疾病晚期(III期或IV期),10年生存率只有5%-21%[9]。肿瘤细胞减灭术联合以铂类及紫杉醇为基础的化疗是晚期卵巢癌患者标准的一线疗法。这种标准治疗方案使得晚期卵巢癌的完全反应率可达到40%-60%,然而超过90%的患者会在18个月后复发,并出现化疗耐药,最终死于卵巢癌[10]。目前对卵巢癌的治疗取得的进展不大,尤其对晚期患者的治疗效果不佳,晚期卵巢容易转移及复发,目前癌免疫治疗仅仅作为临床治疗辅助手段,但被认为是最有希望的治疗手段。四跨膜蛋白超家族成员1(transmembrane 4 L6 family member 1,TM4SF1)也称为肿瘤相关抗原L6(tumor-associated antigen L6,TAL6),其在胰腺癌[11]、肝癌[12]、食管癌[13]、乳腺癌[14]等恶性肿瘤组织中高表达,而在其相应正常实体器官组织中低表达。本课题组在前期研究中从卵巢癌腹水肿瘤细胞构建的c DNA文库中筛选出相关抗原TM4SF1,TM4SF1基因及蛋白在卵巢上皮性癌组织中的表达明显高于卵巢良性肿瘤组织及正常卵巢组织,且恶性程度越高,其表达越高,提示TM4SF1与卵巢癌发生发展密切相关[15-16],从而推断TM4SF1可能具备免疫治疗靶点潜能,来源于该基因的HLA-A2限制性表位肽有可能通过激活CTL,杀灭表达TM4SF1的卵巢癌细胞从而抑制肿瘤生长。本课题组前期研究联合使用量化矩阵法、人工神经网络预测法、基于三维结构和隐马科夫模型预测方法[17-19],对卵巢癌相关抗原TM4SF1 HLA-A2限制性的CTL表位进行预测,筛选出10条卵巢癌相关抗原TM4SF1 HLA-A2限制性的预测表位肽,按其筛选得分的高低命名多肽为P1-P10(具体序列分别为:P1 LLMLLPAFV;P2 MLLPAFVFI;P3SLFSILLAL;P4 CLIQVINGV;P5 MLSSVLAAL;P6 GLAEGPLCL;P7AMLSSVLAA;P8 FVWFFSGIV;P9 ALGGIEFIL;P10 TKYASENHL),并选取了其中4条多肽(P1、P2、P8、P10)进行了免疫反应性验证,结果显示表位多肽P1、P10都具有免疫原性,P10的免疫活性更高,本期实验对其余6条多肽进行免疫反应性验证,筛选出具有免疫反应性的多肽,并对这些具有免疫反应性的多肽进行了进一步的体外验证,结果证实表位肽P10:TKYASENHL可诱导HLA-A2阳性健康志愿者外周血单个核细胞PBMC的特异性CTL,该CTL可特异性杀伤表达TM4SF1及HLA-A2的HO8910PM细胞系,为TM4SF1作为免疫治疗靶点的研究提供理论基础。全文分为以下五个部分:第一部分卵巢癌相关抗原TM4SF1 HLA-A2限制性CTL预测表位与HLA-A2分子的绑定稳定性检测目的检测预测的TM4SF1 HLA-A2限制性的候选CTL表位与HLA-A2分子的绑定稳定性。方法6条多肽及阳性、阴性对照肽均由商业公司合成。体外培养T2细胞,分别以10μg/ml,20μg/ml,30μg/ml,40μg/ml的多肽浓度刺激T2细胞后检测其MIF,比较MIF与刺激浓度的相关性。结果在一定范围内的肽刺激浓度下,多肽P3、P4、P5、P7、P9刺激T2细胞后检测到的MIF均随肽浓度增加而增强(P<0.05),多肽P6刺激T2细胞检测的MIF未随肽浓度增加而增强(P>0.05),相关系数分别为P3(0.679)、P4(0.817)、P5(0.924)、P6(-0.107)、P7(0.625)、P9(0.939)。结论所检测的多肽P3、P4、P5、P7、P9与HLA-A2分子复合物具有良好的绑定稳定性,候选表位肽P6与HLA-A2分子复合物绑定稳定性较差。第二部分转HLA-A2基因小鼠的繁育及鉴定,卵巢癌相关抗原TM4SF1 HLA-A2限制性CTL表位肽的体内免疫反应性检测目的对转HLA-A2基因小鼠进行繁育及鉴定,并检测卵巢癌相关抗原TM4SF1HLA-A2限制性CTL表位多肽在转HLA-A2基因小鼠体内的免疫反应性。方法采用近交系长期同居法进行繁殖,对后代小鼠进行HLA-A2基因鉴定,筛选出转基因阳性雌鼠,联合使用弗氏完全佐剂及弗氏不完全佐剂辅助多肽(P3、P4、P5、P6、P9)免疫转HLA-A2基因的小鼠,分离其脾脏淋巴细胞,进行预培养法ELISPOT检测。分别比较斑点形成数目SFC的净值T(T=实验孔的SFC—阴性对照孔的SFC)和斑点平均大小,分析其活化CTL能力和单细胞分泌IFN-γ水平。分析比较各表位多肽ELISPOT结果,初步鉴定出具有免疫活性的表位肽。结果成功繁育并筛选出转基因阳性雌鼠。阴性对照肽、P4、P6、P9均没有达到阳性标准的SFC出现,阳性肽、P3、P5均有达到阳性标准的SFC出现。结论1.采用近交系长期同居法可成功进行转基因小鼠繁育,在雌鼠分娩后几小时内可再行交配受孕以提高后代小鼠的产率;2.卵巢癌相关抗原TM4SF1 HLA-A2限制性CTL表位肽P3、P5都具有免疫原性,表位肽P4、P6、P9不具有免疫原性,P5比P3具有更强的免疫原性。第三部分有意义的多肽激发HLA-A2阳性卵巢癌病人外周血CTL的免疫反应检测目的检测有意义的多肽在HLA-A2阳性卵巢癌病人外周血是否能够激发特异性CTL的免疫反应。方法选取HLA-A2阳性卵巢癌病人,取其外周血单个核细胞PBMC,分别加入多肽P1、P5、P10刺激培养48h后进行预培养法ELISPOT实验。分别比较斑点形成数目SFC的净值T(T=实验孔的SFC—阴性对照孔的SFC)和斑点平均大小,分析其活化CTL能力和单细胞分泌IFN-γ水平。结果预培养法ELISPOT检测结果提示:阴性对照肽没有达到阳性标准的SFC出现,阳性肽、P1、P5、P10均有达到阳性标准的SFC出现,多肽P1、P10刺激下单个细胞分泌INF-γ因子的水平比P5更高。结论P1、P5、P10能够激发HLA-A2阳性卵巢癌病人外周血CTL的免疫反应,P1及P10的免疫活性更强。第四部分TM4SF1 HLA-A2限制性表位肽负载树突状细胞诱导的特异性CTL体外杀伤作用研究目的检测负载表位肽的人外周血单个核细胞来源树突状细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。方法采用CCK-8法检测表位抗原多肽负载的DC与CD8+T细胞共培养对人卵巢癌细胞HO8910PM及对抗HLA-A2预处理过的HO8910PM的杀伤活性。结果负载P10抗原肽的DCs诱导的CTL在不同效靶比对既表达TM4SF1抗原又表达HLA-A2的人卵巢癌细胞株HO8910PM(HLA-A2+,TM4SF1+)的杀伤作用分别是:40∶1时为(53.31±2.93)%;20∶1时为(32.44±10.81)%;10∶1时为(8.58±7.30)%,均显著高于其余3个肽(P<0.05),而对于抗HLA-A2预处理过的HO8910PM(HLA-A2+,TM4SF1+)的杀伤作用明显下降,分别是:40∶1时为(28.54±2.04)%;20∶1时为(15.47±2.98)%;10∶1时为(1.49±1.26)%。未负载多肽的DC细胞刺激的CD8+T细胞对于HO8910PM(HLA-A2+,TM4SF1+)没有明显杀伤作用。结论1.卵巢癌相关抗原TM4SF1的HLA-A2限制性CTL表位抗原多肽P10负载的DC与CD8+T细胞共培养后杀瘤能力高。2.未负载多肽的DC细胞刺激的CD8+T细胞对于HO8910PM(HLA-A2+,TM4SF1+)没有明显杀伤作用。3.多肽P10具有HLA-A*0201限制性且表达于TM4SF1阳性的肿瘤细胞的表面,能够被自然呈递,是TM4SF1抗原的HLA-A*0201限制性CTL表位。第五部分TM4SF1表位多肽诱导小鼠体内特异性CTL对人卵巢癌细胞的杀灭研究目的TM4SF1表位多肽免疫转HLA-A2基因小鼠,收集其脾细胞作为效应细胞,检测多肽诱导的小鼠体内特异性CTL对人卵巢癌细胞的杀灭效果。方法有意义的多肽免疫转HLA-A2基因小鼠,取其脾细胞,采用CCK-8法检测CTL表位抗原多肽诱发的CTL对人卵巢癌细胞株HO8910PM(HLA-A2+,TM4SF1+)及HO8910PM(HLA-A2+,TM4SF1-)的杀伤活性。结果P10抗原肽免疫的小鼠脾细胞诱导的CTL在不同效靶比对人卵巢癌细胞株HO8910PM(HLA-A2+,TM4SF1+)的杀伤作用是:12.5∶1时为(18.98±2.12)%,25∶1时为(29.63±4.46)%,50∶1时为(34.26±2.89)%,100∶1时为(51.38±5.56)%,均显著高于其余3个肽(P<0.05)。而对于沉默了TM4SF1基因的HO8910PM(HLA-A2+,TM4SF1-)的杀伤作用明显下降:12.5∶1时为(14.47±3.55)%,25∶1时为(14.14±2.67)%,50∶1时为(17.17±5.25)%,100∶1时为(16.50±5.56)%]。结论卵巢癌相关抗原TM4SF1 HLA-A2限制性CTL表位P10抗原肽免疫的小鼠脾细胞诱导的CTL在体外能特异性杀伤靶细胞。