21世纪初有关脊椎动物的发育过程研究受到了广泛关注,在脊椎动物的发育过程中内胚层、中胚层和外胚层的分化是最初发生的细胞命运分化的事件之一。而有关中胚层和外胚层的发育研究已经比较系统和深入,但人们对内胚层的了解却十分有限,关于内胚层发育过程中的细胞命运决定、前后轴的区域划分等重要机制仍不能明确阐述。Tmp21基因定位于在斑马鱼的20号染色体上,是一种能够编码跨膜蛋白的基因,又称p23,也叫p24deltal,是P24基因家族成员之一,这类基因编码的蛋白在内质网向高尔基体的运输过程中发挥着重要作用。Tmp21基因编码产物广泛的存在于细胞的高尔基体、内质网膜上,参与了从内质网到高尔基体的物质运输过程,并在蛋白质的裂解过程中发挥着一定作用,同时在蛋白质运输和膜结构组织中也扮演着重要的角色。Tmp21基因作为P24货物受体家族成员之一,参与了COP囊泡的出芽以及高尔基体的形态建成,该基因被认为作为COP Ⅰ (coat protein)小囊泡外衣蛋白的受体,他主要分布于各种组织细胞的酶原颗粒膜、微粒体膜和质膜表面(如内质网、高尔基体、COP Ⅰ、COPⅡ)。除此之外该基因编码的蛋白质还参与了多种细胞内功能。Tmp21是受到早老素(Presenilin, PS)的调控,是在阿尔兹海默症中的Amyloid precursor protein(APP)是在神经中发挥作用的一种跨膜蛋白质,在APP由前体发育至成熟的APP蛋白质过程中P24 family发挥抑制作用,会导致APP前体不能转化成成熟的蛋白质。Tmp21基因的另一个功能是在阿尔兹海默症中作为γ-secretase的结合蛋白,有报道称Tmp21基因广泛的表达在小鼠的大脑区域,并且与γ-secretase共同定位在神经元上。有趣的是,在小鼠出生后一个月的发育过程中脑部Tmp21基因的表达水平趋于下降。此外,在小鼠的肾脏细胞中部分缺失Tmp21基因的表达会导致高尔基体的膨大。在本项研究中我们将采用斑马鱼作为模式生物对Tmp21基因的功能进行详细研究。针对以上问题,我们首先克隆出斑马鱼的Tmp21基因,对其在斑马鱼中的表达和作用进行系统分析。之后利用显微注射技术,在斑马鱼胚胎发育至1-2个细胞时期注射特异性的吗啡林(morpholinos)修饰性寡核苷酸,内源性抑制该基因在斑马鱼胚胎中的表达,利用显微镜进行活体观察敲降内源性Tmp21基因之后对斑马鱼发育的影响,发现在斑马鱼发育至第四天时的肝脏与对照组相比明显变小,但是斑马鱼整体的体型并无缺陷。由于内胚层的发育过程是相对保守的,因此在低等脊椎动物和哺乳动物二者之间相似性较高,近年来采用斑马鱼作为模式生物展开的有关内胚层的研究进展迅速。在本研究我们将探索该基因在肝脏发育中的发挥的作用,全面了解此基因的功能。首先我们根据前面的实验结果推测认为Tmp21基因对于斑马鱼胚胎早期肝脏形态学发育过程中有重要作用,我们使用转基因斑马鱼系Tg (Ifabp:GFP)、Tg(Gut: GFP)、Tg (soxl7:GFP)进行进一步研究,在这两种转基因鱼系中,前者绿色荧光标记肝脏细胞,后两者均是绿色荧光标记早期内胚层细胞,内源性敲降Tmp21基因后,通过共聚焦显微镜活体追踪观察,发现从早期发育开始肝脏的细胞就有减少趋势,从而导致了到第四天开始肝脏发育畸形的状态,而这些基因敲降所导致的缺陷表型是可以通过注射Tmp21基因的mRNA被部分回救的。随后,我们利用全胚原位杂交(whole mount in situ hybridization)的实验方法来分析Tmp2l基因在斑马鱼胚胎不同发育时期的组织表达模式,根据实验结果可知在发育至第三天时在肝脏区域可检测到其表达。为了更深入了解Tmp21基因在肝脏发育过程中的影响,我们采用肝脏发育中的特异性标记基因hhex、prox1、sepb和cp来检测,结果显示当内源性的Tmp21敲降后,sepb、Cp的表达均明显下调,这说明了Tmp21基因的缺失对肝脏的特化和肝脏的分化过程是有一定影响的。为了进一步确认该基因是否在内胚层特异性表达,我们通过采用流式细胞分选技术,使用转基因鱼系Tg(sox17:GFP)分选出斑马鱼早期发育时期的内胚层细胞和非内胚层细胞,检测到Tmp21基因在早期斑马鱼胚胎中的表达具有普遍性。在做内源性敲降Tmp21基因的表达时候,为了检测是否是注射作用影响了斑马鱼的表型,我们采用将P53 morpholin与Tmp21 morpholino共同注射,排除注射时候可能引起的细胞凋亡对斑马鱼表型的影响,显微观察显示在胚胎发育时期二者共同注射后与野生型胚胎相对比,斑马鱼的肝脏细胞依然有减少的现象。由于有文章报道过Tmp21通过与Protein Kinase Cδ的 Clb亚基上的Asp245和Met266结合发挥作用,Protein Kinase Cδ是与细胞凋亡相关的,且能够抑制细胞周期进程的一种激酶,Tmp21基因是与Protein Kinase Cδ相互作用从而间接影响细胞凋亡的。在本研究中我们将利用TUNEL检测在敲降了Tmp21基因表达后,肝脏部分细胞凋亡情况的变化,发现在注射过Tmp21 morpholino s的胚胎的细胞中凋亡细胞明显增多。斑马鱼内胚层器官的发育所经历的细胞分化和器官形态建成是一个十分复杂的过程。这些器官的正常生长发育对于机体来说是十分重要的,其中任何一个异常现象都有可能导致机体的非正常发育,从而致使疾病发生甚至引起胚胎发育畸形。一个基因的表达缺失都有可能对器官的发育过程产生连锁影响,本研究的进行则能够帮助我们更深入了解在斑马鱼的发育过程中某一基因缺失对其产生的影响以及这一现象的成因。