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中枢神经元损伤分为几种原因,包括创伤、缺血缺氧、中毒等,对人们健康影响巨大,一旦发生此类损伤将会产生严重后果,轻则不能正常生活,影响自己的生活质量,对他人和社会造成严重负担,重则失去生命。尤其是伴随社会的快速发展,机械性、高能量所造成的此类损伤日益增多,因此,研究中枢神经系统损伤一直是科学界的热门研究之一,但是中枢神经系统结构及机制比较复杂,人们至今为止尚不清楚。中枢神经损伤临床上常见损伤可以包括以下三种:氧化应激损伤、神经退化性损伤、兴奋性神经递质中毒性损伤。SHSY5Y细胞系是人骨髓神经母细胞瘤细胞株,衍生于人的神经母细胞瘤细胞系SK2N2SH,它具有神经突样的细胞质突起,表达儿茶酚胺能神经元特有的酪氨酸羟化酶、多巴胺2B2羟化酶和多巴胺转运体,该细胞系被广泛运用于神经元损伤的发病机制研究。本研究根据神经元损伤的不同原因,应用不同浓度的药物作用sh-sy5y细胞系,制作出不同损伤机制的模型:葡萄糖-葡萄糖氧化酶反应造成的氧化应激损伤、直接应用谷氨酸溶液造成的兴奋性氨基酸中毒损伤、6羟基多巴胺造成的神经元变性损伤。首先,我们通过研究神经元损伤时钙离子通道、膜电位变化及凋亡、坏死的测定,研究其损伤特点。根据实验结果,我们发现细胞损伤的三种模型均成功建立,而且药物作用浓度和时间与神经元细胞生存率之间呈线性关系,而且我们研究发现,神经元细胞损伤时,尽管三种损伤机制不同,但是钙离子通道、膜电位及凋亡、坏死等检测指标均有改变:随着神经元细胞损伤的加重,细胞内钙离子浓度增高和膜电位发生降低,而且钙离子增高同时发生细胞膜电位降低。其中,谷氨酸和6-羟基多巴胺最低浓度在作用一定时间时,细胞内钙离子浓度反而降低,同时细胞膜电位反而增高,说明适当浓度的谷氨酸和6羟基多巴胺在一定作用时间内具有神经元保护作用,而氧化应激损伤无此种保护现象。同时,谷氨酸和6羟基多巴胺作用时间较长时才会导致神经元细胞的死亡,氧化应激损伤作用很短时间就会导致神经元死亡,证明神经元耐受缺氧损伤较差。这三种损伤中,谷氨酸兴奋性中毒导致的损伤细胞内钙离子浓度增高最明显,而不同药物在最高浓度所造成的细胞损伤时,其膜电位均无显著性差异,说明谷氨酸损伤机制中钙离子内流占很大作用,而且谷氨酸作用浓度有一明显界值,在高于该浓度时,细胞损伤突然加重,有待于进一步研究。通过MTT检测细胞活性,明确有细胞损伤的时间点和浓度后,通过凋亡、坏死检测,我们发现,谷氨酸造成细胞死亡机制既有凋亡又有坏死,低浓度的谷氨酸可导致神经元早期凋亡,高浓度谷氨酸可导致神经元坏死,而且谷氨酸导致神经元损伤时早期凋亡一直存在;而多巴胺造成细胞损伤以坏死为主,几乎没有早期凋亡,且坏死的细胞数明显呈时间浓度依赖关系;而氧化应激损伤则细胞早期凋亡有显著性差异,坏死无显著性差异,说明其损伤机制为早期凋亡。我们进一步应用Western Blot蛋白电泳研究坏死的损伤机制。现阶段,公认的细胞程序性坏死机制及研究热点是是受体相互作用蛋白RIP1和RIP3蛋白,普遍认为这两种蛋白是坏死关键蛋白,它们相互作用,导致细胞程序性坏死。我们测定了神经元损伤时细胞信号转导蛋白RIP1及RIP3变化,根据Western检测结果,发现谷氨酸损伤神经元的模型中, RIP1蛋白随细胞损伤加重而含量增加,RIP3蛋白无明显变化;多巴胺的坏死机制损伤中,RIP1蛋白也随细胞损伤加重而含量增加,RIP3蛋白随药物时间浓度变化无明显变化;而葡萄糖-葡萄糖氧化酶造成的氧化应激损伤中,RIP1和RIP3蛋白均无明显变化。所以得出结论:三种不同机制形成的神经元细胞损伤,一致的特点为均有细胞内钙离子浓度增高伴随细胞膜电位降低;适当浓度的谷氨酸和6羟基多巴胺在一定作用时间具有神经元保护作用。谷氨酸对细胞损伤机制既包括坏死又包括凋亡,低浓度时,可导致细胞凋亡,高浓度时导致细胞坏死,而且早期凋亡在药物低浓度和高浓度时均存在;多巴胺损伤时,坏死占主导原因,早期凋亡损伤不明显;氧化应激损伤机制主要为早期凋亡,程序性坏死不明显,神经元细胞耐受缺氧较差。而且氧化应激损伤时,坏死关键蛋白RIP1和RIP3无明显变化,符合其死亡机制主要是早期凋亡这一结论;谷氨酸和6羟基多巴胺损伤时,坏死细胞RIP1蛋白随损伤加重含量增加,而坏死另外一个关键蛋白RIP3蛋白含量无变化,提示以下可能性:①从未有人用神经元细胞进行过损伤时RIP1和RIP3蛋白检测实验,可能与神经元细胞本身的特殊性相关,神经元的代谢及生长环境与其他细胞不同,功能也相差很远,因其本身的特殊性,导致其程序性坏死的RIP1蛋白通路与其他细胞系不同,可能存在RIP1蛋白介导的其他蛋白通路;②结果显示RIP3蛋白含量较少,考虑神经元程序性坏死蛋白通路可能是RIP1蛋白介导,通过RIP3蛋白变化(例如磷酸化)发生的,这就导致RIP3蛋白含量整体偏低,如果检测RIP3蛋白磷酸化可能会有新的发现;③可能存在其他的蛋白通路导致神经元程序性坏死,在这种通路中,RIP1蛋白起一定的作用,可能是关键作用,也可能是次要作用,而RIP3蛋白完全不参与这个坏死通路。