论文部分内容阅读
葫芦巴(Trigonella foenum-graecum L.)为豆科一年生草本植物,其种子可入药。种子内胚乳部分富含多糖类物质,又称葫芦巴胶或葫芦巴多糖(fenugreek gum,FG),主要成分为半乳甘露聚糖(Galactomannan),具有调节血糖、抗肿瘤、抗氧化等多种生物学活性,广泛应用于医药、化工、保健品及食品等行业。近年来,通过引入各类官能基团(如硫酸基、磷酸基等)来增强植物多糖的活性已成为天然产物领域的研究热点,其中多糖的硫酸化衍生物因其优异的物理化学性质及生物学活性而受到格外重视。有研究表明,多糖链上不同的硫酸基取代位置(C-6、C-2或C-3)赋予其迥异的生物学活性,合成具有不同取代度及取代位置的多糖活性衍生物具有主要意义。因此,本论文以FG为材料,通过非选择性和区域选择性两种合成途径制备了不同结构特点的葫芦巴多糖硫酸酯(SFG和RSFG),并对其体外抗肿瘤活性进行了初步研究,主要结论如下:1、响应面法优化葫芦巴多糖硫酸酯(SFG)的制备工艺及结构表征通过氯磺酸-吡啶法(CSA/Py)合成了葫芦巴多糖硫酸酯(SFG),通过响应面(RSM)实验确定了最佳反应条件为:CSA/Py的比例1:2.3,反应时间4.3h,反应温度64℃,取代度(DSS)在0.420.56之间,符合模型预期。通过红外光谱(FT-IR)、X射线光电子能谱(XPS)、13C NMR对产物进行了结构表征,SFG结构中已引入硫酸基团,S以S6+形式存在,主要取代位置在C-6位。体积排阻色谱-光散射联用系统(SEC-LLS)测定的平均分子量(MW)显示,酸性反应条件导致MW降低,分子量分布变窄,DSS越高,MW越小,与亚甲基蓝(MB)络合实验证实硫酸基的引入使多糖溶液构象发生了变化,原子力显微镜(AFM)也同样观察到了线型分支状分子形貌修饰后变为短链状,说明硫酸酯化反应对多糖的结构有较大程度的影响。2、区域选择性合成葫芦巴多糖硫酸酯(RSFG)及结构表征针对多糖硫酸酯化反应中酸性条件的限制,选择了对酸有较好稳定性的位阻型硅烷试剂(叔丁基二苯基氯硅烷,TBDPSCl)选择性保护多糖伯羟基,进行了FG的区域选择性硫酸化反应。针对单分子亲核取代反应(SN1)的规律、溶剂效应和多糖伯羟基的活化等影响反应的关键因素,优化了反应条件并分析了可能反应机理;根据多糖硅醚中间体的特性,设计并筛选了不同硫酸酯化反应参数和选择性脱保护体系及条件,区域选择性合成了葫芦巴多糖硫酸酯(RSFG),并对各反应步骤产物进行了结构表征,测定的DSS为0.29,总得率为111.4%。FT-IR、XPS、13C CP/MAS NMR等分析表明,RSFG中硫酸基的取代位置主要在C-2或C-3位,与非选择性合成工艺得到的产物有明显区别。3、FG和SFG的体外抗肿瘤活性的初步研究在成功合成了上述硫酸化衍生物之后,研究了FG及具有不同DS、MW的硫酸酯化衍生物(SFG7、SFG12和SFG13)对人肺癌细胞(A549)、人宫颈癌细胞(Hela)和人肝癌细胞(HepG-2)的体外抑制作用、对细胞周期和调亡的影响。硫酸化修饰后,SFG7对Hela和HepG-2肿瘤细胞的IC50值分别为171.9和196.1μg/mL,SFG13对Hela和HepG-2肿瘤细胞的IC50值分别为181.14和200μg/mL,与文献报道的各类植物多糖硫酸酯相比,显示出了较好的体外抗肿瘤作用。FG显示出了更强的体外抑制肿瘤细胞作用,对A549、Hela和HepG-2肿瘤细胞的IC50值分别为85.04、120.01和148.77μg/mL,但是在细胞周期和凋亡实验中,未发现FG对A549和HepG-2肿瘤细胞有明显的周期阻滞和促凋亡作用,需在今后的研究中,通过对不同的抗肿瘤途径的研究阐明其作用机理。