玉米矮花叶病病原鉴定、检测及外壳蛋白基因变异研究

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1.浙江玉米矮花叶病病原鉴定 从杭州田间表现典型花叶症的玉米病叶中得到病毒分离物ZJ1。以玉米作为病毒繁殖寄主,从中提取到大量线状病毒,病毒粒子大小约740×14nm;病叶组织中观察到大量风轮状内含体及片层聚集体;外壳蛋白亚基分子量大小约33kDa;用甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic viru,SCMV)、玉米矮花叶病毒(Maize dwarf mosaic virus,MDMV)、高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus,SrMV)、约翰逊草花叶病毒(Johnsongrass mosaic virus,JGHV)等4种侵染禾本科的Potyvirus病毒特异性引物,对ZJ1进行RT-PCR扩增,结果用SCMV特异性引物扩增到l条长约0.8kb的DNA片段,经序列测定,片段山781个核苷酸(nt)组成,编码260个氨基酸(aa),序列覆盖近全长CP基因区。比较氨基酸序列同源性,发现该序列与SCMV的同源性最高,达97.8%;与MDMV、SrMV、JGUV等3种病毒的同源性相对较低,分别只有78.8%,73.8%和60.6%。根据马铃薯Y病毒科(Potyviridae)病毒种类和株系划分的标准,将ZJ1鉴定为SCMV。2.甘蔗花叶病毒单克隆抗体制备及检测研究 利用SCMV ZJ1分离物提纯病毒粒子作为抗原免疫BAL B/C小鼠,获得2B5、2E8、3E6等3株单克隆抗体(MAbs)。经间接ELISA方法测定,3株单克隆抗体腹水的效价在1:32000-1:2048000之间;3株单克隆抗体只与SCMV不同分离物发生反应,与玉米粗缩病毒(MRDV)、高梁花叶病毒(SrMV)、马铃薯A病毒(PVA)、小麦黄花叶病毒(WYMV)、西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)、菜豆普通花叶病毒(BCMV)、芜青花叶病毒(TuMV)等7种病毒不发生反应;选择2B5单克隆抗体进行检测灵敏度的测定,结果病叶检测灵敏度为1:10240,提纯病毒检测灵敏度为0.7 ng。表明,2B5单克隆抗体可用于SCMV特异性检测。3.我国12省市玉米矮花叶病病原的检测鉴定 用SCMV浙江分离物(ZJ1)制备的2E5单克隆抗体对浙江杭州、浙江海宁、江苏南京、江苏东台、上海、山东泰安、河南郑州、河北保定、北京、山西太原、山西榆次、陕西杨凌、甘肃兰州、四川成都、云南昆明等12省市15地点的176株玉米矮花叶病样进行了间接ELISA检测,结果全部样品呈阳性反应。从各样品 点分别选取 3株代表性样品,采m IC-RT-PCR方法分别进行 SCMV、MDMV、SrM\,。 几MV等。1种病毒特异性扩增,结果从全部样品中均能扩增到札MV特异性片段, 而用其他3种病毒特异性引物不能扩增出任何片段。综合单抗检测和IC-RI”-PCR 检测结果,认为我囚[“大地区发生的玉米矮花叶病山SCMV引起,且不存在与其 他3种病毒的混合侵染。 4.我国门省市侵染玉米的 SCgr分离物外壳蛋白基因变异与进化 测定了我国门省市 14个 SCMV玉米分离物和 1个高粱红条病原山西分离物 近全长 CP序列,比较了序列 led源性,结果表明 15个分离物呈现出两组间的序列 芹并,浙江、江苏、卜5每、山习二、河南、河北、山西、陕西等8省市11个玉米 分i’t\5物具有极相似的序列,妆灯酸序列P]源性为98.8-99.sfyU,氨基酸序列同源 性为 98.l]0096;村肃、凹)]】、云南等省的 3个玉米分焉物及山西的 1个高粱分 离物具有较一致的序列,核什酸序列同源性为94.5-99.6%,氨基酸序列同源性 为 99.2-100%,两组分离物之问的近全长 CP核昔酸序列同源性仅为 90%人右,氨 基酸序列同源性为97%人h。我闷SC\1\分离物与欧洲分离物门’亲缘关系较近, 与美囚、澳大利亚、南非分离物C!‘亲缘关系较远。 5甘蔗花叶病毒致病性测定 对 SCM\分离物 Zj]和* 在 13个玉米品种上进行了致病性测定,接种 GS 的植株比接种Z刀的植株发病早、病害重、体内病毒浓度高,表明GS对石米的 致病性要强于 ZJ。筛选到 5个高抗 GS和 ZJ的玉米品种,分别为白玉糯 2、苏 玉糯 1、苏玉糯 2、3.t南花秆糯、农大 10s。
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