自噬(Autophagy,AP)是一种重要的细胞分子生物学活动,通过对受损或死亡的细胞、细胞器以及生物大分子的降解和再利用,在维持细胞的静态平衡、发育模式重构、自体免疫以及抵抗逆境胁迫过程中发挥重要的用。自噬的早期研究主要集中于酵母,随后扩展到动物细胞,相比而言,植物自噬的研究起步较晚,并且主要集中在离体培养的细胞,而在个体水平上的研究相对较少。本研究利用携带GFP标签和甘蓝型油菜自噬相关基因Atg8(Bn Atg8)的表达载体,通过农杆菌介导的花序浸染法转化野生型拟南芥,得到了相应Bn Atg8转基因系,并通过形态学比较、GFP和MDC荧光检测以及RT-PCR等技术,分析比较了拟南芥野生型、BnAtg8转基因系以及自噬atg5和atg7突变体在正常生长和逆境胁迫条件下在形态学、生理生化、细胞以及分子生物学中的差异,探究了自噬在植物生长发育以及抗逆活动中的功能。主要结果如下:(1)通过转化及PCR鉴定,成功获得了3个Bn Atg8-拟南芥转基因纯合系,其中两个GFP和BnAtg8二者都有表达(GFP-Bn Atg8转基因系),另一个只Bn Atg8表达(BnAtg8转基因系)。(2)通过半定量RT-PCR法分析比较了20、40、60天苗龄的转基因拟南芥叶片以及50天苗龄植株的叶片、花序茎及果荚中Bn Atg8基因的转录水平,结果发现,不同苗龄转基因系叶片中BnAtg8基因的转录水平存在显著的差异,其中60天的转录水平高于40和20天的转录水平,40天的转录水平又高于20天的转录水平(60d>40>d20d).此外,在叶片中的表达水平高于在花序茎和果荚中的表达水平,在花序茎中的表达水平又高于在果荚中的表达水平(叶片>花序茎>果荚)。(3)激光共聚焦显微观察转基因系根尖GFP荧光分布发现,绿色荧光广泛分布在根尖的各个部位,荧光呈点状分布,其荧光强度从分生区到伸长区至根冠依次减弱。观察转基因植株花粉形成过程中不同时期中细胞内GFP荧光发现,荧光也呈点状分布,并且在四分体时期的荧光强度要高于小孢子。(4)自噬体(泡)特异染色剂MDC染色后荧光显微镜观察发现,转基因植株和野生型根尖所有区域都显示MDC荧光,但转基因根尖的荧光强度高于野生型根尖的荧光强度。(5)观察分析转基因系、野生型和自噬突变体生长过程中的表型发现,在初生根和下胚轴的生长方面,转基因系的生长速率大于野生型的生长速率,而野生型的生长速率又大于自噬突变体的生长速率;在叶面积方面,转基因型的最大,为野生型次之,自噬突变体的最小。在抽薹期方面,转基因系和自噬突变体的相对于野生型的都明显提前,生长周期缩短,其中自噬缺失突变体的变化更为明显。此外,与野生型相比,转基因系的株高和种子产量没有明显的改变,而自噬突变体的株高明显变矮,单株种子产量也明显降低。(6)生理学研究发现:在饥饿胁迫下,野生型和转基因系的萌发率无明显差异,但是两个自噬突变体的萌发率要远远低于野生型;在盐胁迫下,在种子萌发率方面,转基因系明显地高于自噬突变体,但又低于野生型。以上结果表明,油菜BnAtg8的表达对拟南芥的生长发育,耐环境胁迫的能力以及自噬活动的强度有明显的影响。这种情况表明,自噬在调节植物生长发育方面也可能发挥一定的作用。这种作用对于植物的生长发育来说既有积极的的一面也有消极的一面,只有适量强度的自噬才利于植物的生长发育。