论文部分内容阅读
目的:白血病干细胞（leukemia stem cells,LSC）能在化疗和放疗后生存下来而成为白血病耐药及复发的根源。为明确白血病干细胞与白血病治疗抗性的关系和探寻靶向白血病干细胞的耐药干预措施,本研究比较观察白血病药物敏感和耐受细胞中白血病干细胞及其生物学特性;研究小白菊内酯（parthenolide,PTL）对药物敏感和药物耐受细胞中白血病干细胞的杀伤效应,探讨小白菊内酯抗耐药性白血病的作用及机制。方法:以白血病多药耐药株K562/ADM细胞及其药物敏感的亲本K562细胞为模型,采用流式细胞术检测干细胞免疫标志,以及耐药蛋白P-糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）和乳腺癌耐药蛋白（breast cancer resistance protein,BCRP）的表达;四氮唑蓝比色法（MTT法）测定细胞增殖活性,Annexin V/PI双标记法检测凋亡细胞,甲基纤维素集落形成法检测细胞的自我更新和增殖潜能。结果:（1）K562/ADM细胞CD34+、CD123+、CD34+CD38-和CD34+CD123+细胞亚群的含量均显著高于K562细胞（P＜0.01）。K562/ADM细胞中LSC（CD34+CD38-CD123+）含量为（5.23±0.21）%,K562细胞为（1.27±0.17）%,K562/ADM细胞LSC含量约为K562细胞的4倍。K562细胞几乎不表达P-gp和BCRP,分别为（5.63±0.15）%和（3.14±0.42）%,而K562/ADM细胞高表达P-gp和BCRP,分别为（96.45±0.07）%和（13.10±0.74）%。在K562细胞和K562/ADM细胞中共表达P-gp及BCRP者分别为（1.16±0.07）%和（13.05±0.78）%,K562/ADM细胞中P-gp+BCRP+细胞含量是K562细胞的11.3倍。K562/ADM细胞中CD34+细胞、CD123+细胞和CD34+CD38-CD123+细胞表达BCRP者显著高于K562细胞,K562/ADM细胞中CD34+细胞亚群、CD123+细胞亚群和CD34+CD38-CD123+细胞亚群BCRP的表达分别为（5.77±1.14）%、（5.50±0.69）%和（4.13±0.40）%,K562细胞为（1.40±0.23）%、（1.59±0.14）%和（1.13±0.15）%,与LSC含量极其接近。K562细胞和K562/ADM细胞中CD34+CD38-细胞共表达P-gp和BCRP（CD34+CD38-P-gp+BCRP+）者分别为（0.51±0.01）%和（5.80±1.19）%,K562/ADM细胞约是K562细胞的11.4倍;在K562细胞和K562/ADM细胞中,CD34+CD38-细胞群中P-gp和BCRP共表达者分别为（22.65±2.05）%和（51.00±5.10）%,K562/ADM细胞约是K562细胞的2.3倍。细胞在甲基纤维素半固体培养基中的集落形成能力反映细胞的自我更新和增殖潜能。K562/ADM细胞的集落形成能力高于K562细胞。培养5d的早期集落形成率K562细胞为（6.97±0.53）%,K562/ADM细胞为（9.27±1.00）%,两者差异较小。但培养10d的晚期集落形成率K562细胞为（1.80±0.60）%,K562/ADM细胞为（7.50±0.55）%,K562/ADM细胞晚期集落形成率是K562细胞的约4倍,其集落形成率与其LSC含量大致相当。分析集落形态,早期集落大而疏松,晚期集落较小、组成细胞致密;培养10天以上,早期集落细胞多数已死亡崩解。（2）小白菊内酯（PTL）呈时间浓度依赖性地抑制K562细胞和K562/ADM细胞的增殖（P＜0.01）。PTL作用24h、48h、72h和96h,K562细胞的IC50分别为17.1μmol/L,8.67μmol/L、9.42μmol/L和4.64μmol/L;K562/ADM细胞分别为22.01μmol/L,9.01μmol/L、16.82μmol/L和13.96μmol/L。但随着时间的延长,PTL对K562/ADM细胞的抑制作用反而有所降低。5μmol/L和10μmol/L PTL处理12h和48h,Annexin V/PI染色显示凋亡细胞显著增高,且K562/ADM细胞高于K562细胞,K562细胞凋亡率分别为43.48%和65.80%、49.15%和69.50%,K562/ADM细胞分别为75.98%和83.10%、85.12%和94.10%。结合干细胞免疫标志分析LSC样（CD34+CD38-）细胞的凋亡,5μmol/L和10μmol/L PTL处理48h,K562细胞和K562/ADM细胞中LSC样细胞的凋亡率分别为（52.63±4.14）%和（57.50±4.47）%、（84.70±4.81）%和（96.37±1.99）%。5μmol/L和10μmol/L PTL处理48h,K562细胞、K562/ADM细胞中LSC的含量略有降低,分别为（1.27±0.15）%和（1.53±0.31）%、（4.77±0.47）%和（3.37±0.51）%;但15μmol/L处理,LSC含量明显增高,K562细胞、K562/ADM细胞分别为（22.40±2.46）%和（7.80±0.62）%。经PTL处理后,BCRP表达随着浓度的增加而增高,K562细胞由（1.35±0.08）%增高到（7.13±0.32）%,K562/ADM由（11.03±0.50）%增高到（41.4±0.61）%;结合干细胞表面标志分析,经PTL处理后LSC的BCRP表达也随PTL浓度的增高而增加,K562细胞的表达增加较为明显。在半固体培养基中直接加入0.5μmol/L～4.0μmol/L PTL,K562细胞和K562/ADM细胞的早期集落及晚期集落形成的均受到显著抑制,K562细胞较敏感。5μmol/L～15μmol/L PTL预处理48h,存活K562细胞和K562/ADM细胞的早期集落形成能力轻度增高,而晚期集落数则明显增高,尤以K562/ADM耐药细胞的晚期集落数增高更为明显。结论:白血病耐药细胞群中存在较高含量的高表达药物转运蛋白的LSC,耐药性LSC可能是白血病治疗抗性的根源。小白菊内酯显著抑制药物敏感的K562细胞和耐药的K562/ADM白血病细胞及其干细胞的增殖活性,并诱导其凋亡;小白菊内酯可杀伤白血病干细胞,但耐药性LSC对小白菊内酯具有部分抗性。