论文部分内容阅读
研究背景:糖尿病肾脏病（diabetic kidney disease,DKD）是由糖尿病引起的一种严重微血管并发症。目前是造成终末期肾病（end stage renal disease,ESRD）主要的病因之一。DKD的发病机制十分复杂,遗传因素、代谢紊乱、氧化应激、炎症、自噬等机制,各种机制之间又相互关联,共同促进糖尿病肾病的发生发展。但是目前临床上控制高血糖、高血压、高血脂以及肾素-血管紧张素系统抑制药等基础治疗仍然不能完全延缓DKD的发生发展。目前针对于糖尿病肾病尚无更有效的治疗方法,因此为提高疗效寻找新的或潜在治疗靶点十分必要。间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）是一种来源于中胚层的成体干细胞,具有增殖更新和多向分化的功能,这使其具有很好的可塑性,可以从各种组织中分离出来,如骨髓、脐带、脂肪、外周血、肝脏、牙龈等,其中骨髓含量最为丰富。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）由于其容易获得和细胞数量充足,故较多应用于实验研究中。MSCs来源的外泌体（Exosomes secreted from mesenchymal stem cells,MSC-Exos）具有与MSCs相似的组织损伤修复和再生功能。MSCs分泌的外泌体不仅对糖尿病有治疗作用,而且在糖尿病并发症的方面具有组织修复的作用。外泌体作为细胞之间信号传递的载体,通过促血管生成、营养作用、抗凋亡、免疫调节等作用修复肾脏,其中miRNA作为外泌体中的主要成分,在外泌体功能实现过程中发挥着关键的调控作用,但是外泌体中miRNA在DKD发生发展中的具体机制仍有待进一步深入研究。自噬（autophagy）是由溶酶体参与的代谢途径,在各种应激下通过降解并回收受损的细胞器和大分子以维持细胞内的稳态。当细胞受到损伤时起到保护细胞的作用。自噬功能失调在各种疾病中起着致病的作用。糖尿病引起的自噬失调在肾脏肾小球和肾小管间质病变中起着关键的作用。高糖状态下肾脏细胞自噬功能受损,尤其是足细胞和肾小管细胞的自噬功能受损,与DKD发生发展密切相关。研究发现miRNA通过不同机制参与DKD的病理生理过程。miRNA是自噬重要的调控因子之一,miRNA可通过调控自噬相关的信号通路和自噬相关基因（autophagy related gene,ATG）调控自噬,从而影响DKD的发展过程。miRNA可能是调节糖尿病肾病的潜在干预靶点。Mi R-125b是一种调控细胞增殖凋亡重要的miRNA。近年来发现在糖尿病患者体内miR-125b低表达,在糖尿病肾病患者的尿液中发现外泌体中的miR-125b表达下调。miR-125b在2型糖尿病的发生、发展中起着重要的作用。miR-125b参与DKD的发生。来源于心血管内皮细胞的外泌体miR-125b可以诱导细胞自噬,从而抑制心肌梗死的进展。目前外泌体中的miR-125b对糖尿病肾病的具体作用还不十分清楚。在高糖诱导的足细胞损伤研究中,发现抑制丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine-threonine kinase,AKT）信号通路可以诱导自噬和抑制细胞凋亡。肿瘤坏死因子受体相关因子6（Tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6）的活化是AKT信号通路激活的关键环节。TRAF6可诱导DKD的进展。TRAF6的失活可能导致细胞自噬。TRAF6参与自噬的调控,可以通过上调AKT下游哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,m TOR）的活性来调节自噬。TRAF6是否通过调控AKT信号通路来调节自噬而影响DKD的发生发展有待进一步研究。已知骨髓间充质干细胞来源的外泌体（Exosomes secreted from bone mesenchymal stem cells,BMSC-Exos）有延缓糖尿病肾病的作用,BMSC-Exos来源的miR-125b是否通过TRAF6/AKT轴对高糖（High Glucose,HG）诱导人胚肾上皮细胞（human embryonic kidney epithelial cells,HKCs）凋亡的保护作用,值得我们进一步去研究。因此本研究主要探讨BMSC-Exos来源的miR-125b对高糖诱导人胚肾上皮细胞凋亡的保护作用及机制研究。第一部分BMSC-Exos通过miR-125b诱导HG损伤HKCs自噬和抑制凋亡目的:研究HG损伤HKCs中、BMSC-Exos中以及HG损伤HKCs与BMSC-Exos共培养中miR-125b的表达,进一步研究BMSC-Exos对HG损伤HKCs自噬和凋亡的影响及转染miR-125b inhibitor的BMSC-Exos对HG损伤HKCs自噬和凋亡的影响。方法:1、构建HG损伤HKCs模型和HG损伤HKCs与BMSC-Exos共培养模型,随机为HKC组、Mannitol+HKC组、L-Glu+HKC组、H-Glu+HKC组、MSC-exo组、H-Glu+HKC+MSC-exo组。实时定量PCR（RT-q PCR）检测各组miR-125b的表达。BMSCs加入GW4869（外泌体抑制剂）后分泌的外泌体与HG损伤HKCs共培养,RT-q PCR检测miR-125b的表达变化。2、在HG损伤HKCs中和HG损伤HKCs与BMSC-Exos共培养中加入自噬抑制剂（bafilomycin A1,Baf A1）,Western blot检测各组LC3II/LC3I、P62的蛋白水平,流式细胞仪检测Annexin V/PI染色后各组的凋亡率。3、转染miR-125b inhibitor的BMSC-Exos对HG损伤HKCs自噬和凋亡的影响。转染抑制剂对照（inhibitor NC）或miR-125b inhibitor到BMSCs,RT-q PCR检测方法验证转染效率;转染后BMSCs分泌的外泌体与HG损伤的HKCs共培养,RT-q PCR检测各组HKCs中miR-125b的表达,同时应用Western blot检测各组LC3II/LC3I、P62的蛋白水平,流式细胞仪检测Annexin V/PI染色后各组的凋亡率。结果:1、HG损伤HKCs中miR-125b的表达显著下降,在BMSC-Exos中miR-125b的表达显著增加,HG损伤HKCs与BMSC-Exos共培养后miR-125b表达显著增加,说明BMSCs分泌的外泌体逆转HG损伤HKCs的miR-125b表达下调。BMSCs加入GW4869（外泌体抑制剂）后分泌的外泌体与HG损伤HKCs共培养后,miR-125b表达明显下降,说明GW4869逆转BMSC-Exos上调miR-125b的作用。证实miR-125b是通过BMSC-Exos传递至HKCs中。2、HG损伤HKCs中的LC3II/LC3I蛋白水平下降,P62蛋白水平升高;当HG损伤HKCs与BMSC-Exos共同培养后,LC3II/LC3I蛋白水平高,P62蛋白水平低,说明BMSC-Exos诱导HG损伤HKCs的自噬。然而,加入Baf A1后,即使BMSC-Exos存在下HKCs的自噬无明显改善,证实BMSC-Exos诱导自噬的作用能被自噬抑制剂逆转。HG损伤HKCs的凋亡率显著增加,HG损伤HKCs与BMSC-Exos共同培养后凋亡率显著减少,说明BMSC-Exos抑制HG损伤HKCs的凋亡。3、转染miR-125b inhibitor组miR-125b表达明显下降,说明miR-125b inhibitor的转染有效。HG损伤HKCs与BMSC-Exos共同培养后,miR-125b的表达升高,LC3II/LC3I的蛋白水平升高,p62蛋白水平下降,凋亡率下降,转染miR-125b inhibitor的BMSC-Exos与HG损伤HKCs共培养后,miR-125b的表达显著下降,LC3II/LC3I的蛋白水平下降,p62蛋白水平升高,凋亡率增加。结论:1、Mi R-125b通过BMSCs分泌的外泌体传递至HKCs中。2、HG损伤HKCs的自噬减少,BMSC-Exos能有效恢复HG损伤HKCs的自噬,这种作用能被自噬抑制剂逆转。3、HG诱导HKCs的凋亡,BMSC-Exos抑制HG损伤HKCs的凋亡。4、转染miR-125b inhibitor的BMSC-Exos诱导HG损伤HKCs自噬和抑制凋亡的作用被逆转。综上所述,BMSC-Exos通过miR-125b诱导HG损伤HKCs自噬和抑制凋亡。第二部分BMSC-Exos来源的miR-125b通过靶向TRAF6诱导HG损伤HKCs自噬和抑制凋亡目的:验证miR-125b与TRAF6的靶向结合关系,BMSC-Exos来源的miR-125b通过靶向TRAF6诱导HG损伤HKCs自噬和抑制凋亡。方法:1、转染inhibitor NC或者miR-125b inhibitor到BMSCs,转染后BMSCs分泌的外泌体与HG损伤HKCs共培养,观察miR-125b对TRAF6表达的影响,RT-q PCR检测各组TRAF6 m RNA的表达,Western blot检测各组TRAF6蛋白水平。2、通过使用生物信息学分析工具（Targetscan）,在线预测TRAF6基因的3’UTR是miR-125b的靶标,双荧光素酶报告基因检测进一步验证TRAF6与miR-125b之间的靶标关系。含有miR-125b可能结合位点的TRAF6的3’UTR,将其克隆到p GL3-双荧光素酶表达载体中,构建野生型或突变型报告载体TRAF6（wt/mut）。将TRAF6（wt/mut）与mimic NC或inhibitor NC或miR-125b模拟剂（mimic）或miR-125b抑制剂（inhibitor）分别转染到HKCs中,随机分为mimic NC+wt-TRAF6组、miR-125b mimic+wt-TRAF6组、inhibitor NC+wt-TRAF6组、miR-125b inhibitor+wt-TRAF6组、mimic NC+mut-TRAF6组、miR-125b mimic+mut-TRAF6组、inhibitor NC+mut-TRAF6组、miR-125b inhibitor+mut-TRAF6组,双重荧光素酶报告基因检测HKCs中TRAF6 3’-UTR质粒的荧光素酶活性。3、构建TRAF6过表达载体,与载体对照（vector）分别转染HG损伤HKCs,转染后与BMSC-Exos共培养,RT-q PCR检测各组TRAF6 m RNA表达,Western blot检测各组TRAF6蛋白水平。4、Western blot检测各组LC3II/LC3I、P62的蛋白水平,流式细胞仪检测Annexin V/PI染色后HKCs的凋亡率。结果:1、HG损伤HKCs与BMSC-Exos共同培养后,TRAF6 m RNA的表达显著下降,提示BMSC-Exos来源的miR-125b抑制TRAF6 m RNA表达;转染miR-125b inhibitor的BMSC-Exos与HG损伤HKCs共培养后,TRAF6 m RNA的表达显著增加,提示敲低miR-125b促进TRAF6 m RNA表达。HG损伤HKCs与BMSC-Exos共同培养后,TRAF6蛋白水平显著下降,提示BMSC-Exos来源的miR-125b抑制TRAF6蛋白水平;转染miR-125b inhibitor的BMSC-Exos与HG损伤HKCs共培养后,TRAF6蛋白水平显著升高,提示敲低miR-125b促进TRAF6蛋白表达。2、成功构建TRAF6基因的野生型（wt-TRAF6）和突变型（mut-TRAF6）3’UTR的p GL3-荧光素酶报告载体后,双重荧光素酶报告基因检测表明,与突变质粒转染组相比,miR-125b mimic可显著降低wt-TRAF6 TRAF6 3’-UTR质粒的荧光素酶活性,而miR-125b inhibitor可显著增加wt-TRAF6 TRAF6 3’-UTR荧光素酶活性升高。当miR-125b mimic或inhibitor与mut-TRAF6共转染时,HKCs的荧光素酶活性保持不变。3、HG损伤HKCs与BMSC-Exos共同培养后,TRAF6 m RNA表达下降,TRAF6蛋白水平下降;过表达TRAF6的HG损伤HKCs与BMSC-Exos共同培养后,TRAF6 m RNA表达增加,TRAF6蛋白水平升高。4、HG损伤HKCs与BMSC-Exos共同培养后,LC3Ⅱ/LC3I蛋白水平明显升高、P62蛋白水平下降,凋亡率明显下降;过表达TRAF6的HG损伤HKCs与BMSC-Exos共同培养后,的LC3Ⅱ/LC3I蛋白水平下降、P62蛋白水平升高,凋亡明显增加。说明BMSC-Exos通过抑制HG损伤HKCs中TRAF6的表达,诱导HKCs的自噬,抑制HKCs的凋亡,过表达TRAF6后,与BMSC-Exos共培养的HG损伤HKCs的自噬减少,凋亡增加。结论:1、Mi R-125b抑制TRAF6表达,miR-125b敲低促进TRAF6表达。2、HKCs中TRAF6是miR-125b直接靶标。3、BMSC-Exos抑制HG损伤HKCs中TRAF6的表达。4、BMSC-Exos通过抑制HG损伤HKCs中TRAF6的表达,诱导HKCs自噬和抑制凋亡,过表达TRAF6可以逆转BMSC-Exos对HG损伤HKCs的诱导自噬和抗凋亡的作用。综上所述,BMSC-Exos来源的miR-125b通过靶向TRAF6诱导HG损伤HKCs的自噬和抑制凋亡。第三部分:BMSC-Exos来源的miR-125b通过TRAF6/AKT轴对HG诱导HKCs凋亡的保护目的:为进一步证实BMSC-Exos来源的miR-125b通过TRAF6/AKT轴对HG诱导HKCs凋亡的保护。方法:1、构建TRAF6过表达载体,与载体对照（vector）分别转染到HG损伤HKCs,转染后与BMSC-Exos共培养,Western blot检测AKT、P-AKT蛋白水平。2、转染inhibitor NC或miR-125b inhibitor转染到BMSCs,转染后BMSCs分泌的外泌体与HG损伤HKCs共培养,或加入MK-2206（AKT抑制剂）,随机分为:H-Glu组、H-Glu+MSC-exo组、H-Glu+MSC-exo+inhibitor NC组、H-Glu+MSC-exo+miR-125b inhibitor组、H-Glu+MSC-exo+MK-2206组、H-Glu+MSCexo+MK-2206+miR-125b inhibitor组,RT-q PCR检测miR-125b m RNA和TRAF6mRNA的表达。3、改变miR-125b的表达,对TRAF6、AKT、P-AKT的影响,Western blot检测TRAF6、AKT、P-AKT蛋白水平。4、改变miR-125b的表达,对HKCs自噬的影响,Western blot检测LC3II/LC3I、P62蛋白水平。5、改变miR-125b的表达,对HKCs凋亡的影响,流式细胞仪检测Annexin V/PI染色后HKCs的凋亡率。结果:1、HG损伤HKCs与BMSC-Exos共同培养后,P-AKT/AKT蛋白水平下降;过表达TRAF6的HG损伤HKCs与BMSC-Exos共同培养后,P-AKT/AKT蛋白水平显著升高,说明BMSC-Exos通过下调TRAF6抑制AKT磷酸化,TRAF6过表达促进AKT磷酸化。2、与H-Glu组相比,H-Glu+MSC-exo组miR-125b mRNA表达显著增加,TRAF6 m RNA表达显著下降;与H-Glu+MSC-exo+inhibitor NC组相比,H-Glu+MSC-exo+miR-125b inhibitor组miR-125b m RNA表达显著下降,TRAF6m RNA表达显著增加;加入MK-2206,miR-125b m RNA表达和TRAF6 m RNA表达无明显差异。说明BMSC-Exos来源的miR-125b下调TRAF6的表达,抑制miR-125b上调TRAF6的表达,所以miR-125b抑制TRAF6的表达。3、与H-Glu组相比,H-Glu+MSC-exo组TRAF6蛋白水平显著下降、P-AKT/AKT蛋白水平下降;与H-Glu+MSC-exo+inhibitor NC组相比,H-Glu+MSC-exo+miR-125b inhibitor组TRAF6蛋白水平显著升高、P-AKT/AKT蛋白水平升高;与H-Glu+MSC-exo组相比,H-Glu+MSC-exo+MK-2206组TRAF6蛋白水平显著下降、P-AKT/AKT蛋白水平下降;与H-Glu+MSC-exo+miR-125b inhibitor组相比,H-Glu+MSC-exo+MK-2206+miR-125b inhibitor组TRAF6蛋白水平无统计学差异,但P-AKT/AKT蛋白水平下降。上述结果表明,BMSC-Exos来源的miR-125b下调TRAF6的表达和抑制AKT的磷酸化,而抑制miR-125b的BMSC-Exos上调TRAF6的表达和促进AKT的磷酸化,而MK-2206逆转miR-125b下调引起AKT的磷酸化,对TRAF6表达无影响。研究证实BMSC-Exos来源的miR-125b抑制TRAF6表达和AKT的磷酸化。4、与H-Glu组相比,H-Glu+MSC-exo组LC3II/LC3I蛋白水平显著升高、P62蛋白水平显著下降;与H-Glu+MSC-exo+inhibitor NC组相比,H-Glu+MSC-exo+miR-125b inhibitor组LC3II/LC3I蛋白水平下降、P62蛋白水平升高;与H-Glu+MSC-exo+miR-125b inhibitor组相比,H-Glu+MSC-exo+MK-2206+miR-125b inhibitor组LC3II/LC3I蛋白水平升高、P62蛋白水平下降;上述结果表明BMSC-Exos来源的miR-125b诱导HG损伤HKCs的自噬,而抑制miR-125b的BMSC-Exos抑制HKCs的自噬,MK-2206逆转miR-125b下调导致HKCs的自噬抑制,研究证实BMSC-Exos来源的miR-125b通过AKT信号通路诱导HG损伤HKCs的自噬。5、与H-Glu组相比,H-Glu+MSC-exo组凋亡率显著减少;与H-Glu+MSC-exo+inhibitor NC组相比,H-Glu+MSC-exo+miR-125b inhibitor组凋亡率显著增加;与H-Glu+MSC-exo+MK-2206组相比,H-Glu+MSC-exo+MK-2206+miR-125b inhibitor组凋亡率显著增加。与H-Glu+MSC-exo+miR-125b inhibitor组相比,H-Glu+MSC-exo+MK-2206+miR-125b inhibitor组凋亡率减少;上述结果表明BMSC-Exos来源的miR-125b抑制HG损伤HKCs的凋亡,抑制miR-125b的BMSC-Exos促进HKCs的凋亡,而MK-2206可逆转miR-125b下调促进HKCs凋亡的作用。研究证实BMSC-Exos来源的miR-125b通过抑制AKT信号通路,诱导HG损伤HKCs的自噬和抑制凋亡。结论:1、BMSC-Exos下调TRAF6抑制AKT磷酸化,过表达TRAF6促进AKT磷酸化。2、Mi R-125b抑制TRAF6的表达。3、BMSC-Exos来源的miR-125b抑制TRAF6表达和AKT的磷酸化。4、BMSC-Exos来源的miR-125b通过AKT信号通路诱导HKCs自噬。5、BMSC-Exos来源的miR-125b通过AKT信号通路抑制HKCs凋亡。综上所述,证实BMSC-Exos来源的miR-125b通过TRAF6/AKT轴对HG诱导HKCs凋亡的保护。