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金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种常见的病原菌，也是各种原发感染细菌的生物。创伤内植物相关性感染败血症病原菌，金黄色葡萄球菌占15.4%，排名第二。金黄色葡萄球菌作为生物膜的主要组成部分，可以通过集体免疫系统的识别，从而具备很高的耐药性。该种感染不容易被控制，所以，对于抑制金黄色葡萄球菌生物膜研究就极具价值。人β-防御素-3（Human beta-defensin3，HBD-3）是一种新发现的人体骨细胞产生的抗菌肽，对金葡菌有极强的杀伤力。与其结构相似的α-防御素有抗生物膜作用，但HBD-3对生物膜的作用未见报道。我们推测HBD-3对金葡菌生物膜可能也有作用。因此，我们对HBD-3对金黄色葡萄球菌生物膜的影响进行了探讨。金黄色葡萄球菌形成生物膜的过程分为定植阶段（0-3hours）粘附阶段（3-6hours）、聚集阶段(6-12h)、成熟阶段(18-24h)、老化阶段（72h以后）。我们对金黄色葡萄球菌生物膜的形成过程分阶段的划分，对HBD-3作用于金葡菌生物膜各个阶段的影响进行研究。目前对金黄色葡萄球菌生物膜的形成机制仍不清楚。初步研究表明，生物膜的形成首先连接到细胞壁相关因素的调节细胞表面，然后细菌介导的介导因子是一种叫做多糖胞间粘附素(polysaccharide intercellular adhesin，PIA)的物质，细胞增殖和细胞团块聚集到对方，然后形成生物膜。这个过程涉及在生物膜形成的多种基因。用对特定的金黄色葡萄球菌实验室菌株敲除icaA基因的研究发现，icaA缺失的菌株在某些条件下仍能形成生物膜。另外， dltABCD操纵子也被认为是生物膜形成的关键调控因素之一。RNA干扰可以有效的抵制基因的靶向性，和“基因敲除”记为相似，主要是与siRNA转录后导致基因不能表达的现象。有报道能够代替基因打靶技术。我们构建dltB基因siRNA干扰质粒，为探讨机制提供了一条新的思路。材料与方法：菌株：金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923；动物：Wister SD大鼠；试剂：HBD-3、万古霉素、克林霉素；荧光增白剂、LIVE/DEAD试剂盒；试样：镍铬合金、铝合金、超高分子聚乙烯；仪器：激光扫描共聚焦显微镜。1. HBD-3对金黄色葡萄球菌生物膜的作用：实验分组按照药物试剂类别及其最低抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration,MIC）的倍数梯度1/2MIC、1MIC、2MIC、4MIC分组。HBD-3为4、8、16、32ug/ml的浓度梯度，万古霉素为0.25、0.5、2、8ug/ml的浓度梯度，克林霉素为0.125、0.25、0.5、1.0ug/ml的浓度梯度。将金黄色葡萄球菌培养后，分别于3、6、12、18、24h等时间节点加入各组药物，药物作用6h后染色观察。荧光增白剂染色生物膜用于评估生物膜的改变；LIVE/DEAD探针对死活菌区别染色用于评估膜内的活菌率。激光共聚焦显微镜观察HBD-3、万古霉素、克林霉素对金葡菌生物膜以及膜内活菌生存率的影响。2. HBD-3对金黄色葡萄球菌生物膜影响机制的研究：金葡菌培养分别加入HBD-3、万古霉素、克林霉素，培养6h、24h后提取总RNA；逆转录合成cDNA；实验需求设计PCR引物，用设计得到的菌株cDNA为模板，进行PCR扩增检测。3.利用生物信息学，对目的序列进行筛选，合成了三对64nt寡核苷酸。与BamHI和HindIII酶切的质粒pRNAT-U6.1/NEO连接,转化大肠杆菌DH5a。质粒扩增后经酶切、测序鉴定。4.HBD-3对内植物材料形成金黄色葡萄球菌生物膜影响的体外及体内研究：按照常用医用内植物材料镍铬合金、铝合金及高分子聚乙烯分组，分别与金黄色葡萄球菌共同培养，按时间节点分别加入HBD-3、万古霉素、克林霉素以及HBD-3+万古霉素或者HBD-3+克林霉素，染色后激光共聚焦显微镜观察；体内试验分为HBD-3组、万古霉素组及氯克林霉素组，建立大鼠皮下囊内植物感染模型，置入超高分子聚乙烯试样，在置入前试样分别在生理盐水、浓度8ug/ml的HBD-3、浓度0.5ug/ml万古霉素及浓度0.25ug/ml氯林可霉素等各药液组中浸泡20分钟，缝合后将金黄色葡萄球菌菌液注入皮下囊，术后观察大鼠生命体征变化和不同时间点的存活率，并观察试样表面金黄色葡萄球菌生物膜及膜内活菌变化。结果：1.有3株金黄色葡萄球菌形成金黄色葡萄球菌生物膜，其中以金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923最明显。在初始粘附阶段，HBD-3、万古霉素、克林霉素都促进了金葡菌ATCC25923分泌多糖基质的增加，使细菌分泌多糖基质时间提前。药物作用于已形成的金葡菌生物膜时，HBD-3和克林霉素能够减少金葡菌生物膜，万古霉素对成熟生物膜及生物膜内的细菌没有作用；对已形成的金葡菌生物膜，HBD-3浓度大于2MIC时能够减少生物膜内活菌率。2.在细菌与表面的粘附期以及生物膜初始形成期， HBD-3对金葡菌标准菌株ATCC25923中dltB及icaA的转录水平无明显影响，克林霉素则能够刺激dltB及icaA的转录水平显著上调，万古霉素也能上调dltB的表达，但加入万古霉素的菌株在生物膜粘附聚集期icaA转录水平无明显改变，在生物膜初步形成期icaA转录水平出现了显著上调。3.成功构建3个dltB基因的siRNA表达质粒载体（pRNAT-U6.1/NEO-shRNA-1、pRNAT-U6.1/NEO-shRNA-2、pRNAT-U6.1/NEO-shRNA-3），测序证实插入序列正确。4.体外研究：加入HBD-3后，镍铬合金，铝合金，超高分子量聚乙烯各组表面生物膜形成均减少。HBD-3+万古霉素、HBD-3+克林霉素组均能显著减少金黄色葡萄球菌生物膜的形成。大鼠术后情况，万古霉素组全部存活，克林霉素组第四天死亡1只，HBD-3第三天及第四天各死亡1只，空白对照组第二、三、四、五天各死亡1只。体内实验HBD-3组生物膜没有显著减少。结论：1.HBD-3能显著抑制金葡菌生物膜形成能力、降低生物膜内活菌数，对已形成的生物膜的也有同样明显抑制效果。此抗菌肽是治疗金葡菌感染以及抑制外科内植物感染的有效工具。2.对于基因dltB和icaA这些形成生物膜的关键因素，和克林霉素、万古霉素不同的是，HBD-3不会上调它们的表达，从而不会诱发生物膜的产生。3. HBD-3与在体外能够抑制内植物表面金黄色葡萄球菌生物膜的形成，并且与万古霉素、克林霉素等抗菌药对金黄色葡萄球菌生物膜感染有协同作用，但体内试验尚未发挥出其应有抗生物膜特性。上述研究结果为阐明HBD-3对金葡菌生物膜的抑制作用提供了有力的实验依据，并对其机制进行了一些初步探讨，为金葡菌生物膜感染的治疗提供了新的思路，但其用于临床还需要进一步深入研究。