研究背景据WHO估计,近年来全世界每年约有1,060万梅毒新发病例。我国梅毒的报告感染率和发病率也呈直线上升趋势,2015年度全国梅毒报告发病数为458,682例,较2011年增长16%。因此,对梅毒进行有效的监控及防治已成为我国乃至全球公共卫生普遍关注的重点。对梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)进行基因分型不仅能揭示梅毒传播的规律,还能从分子水平区分不同的菌株型别,判定梅毒患者的感染状态,了解不同型别与特定临床症状的关系。当前,各国学者普遍采用的梅毒分型方法是arp/tpr/tp0548三基因分型法,该分型系统稳定、鉴别能力强,是开展梅毒流行病学调查的有力工具。耐药是导致梅毒患者临床治疗失败的主要因素。近年来国内外报道的耐红霉素、阿奇霉素的Tp菌株逐年增加,因此开展本地区Tp对大环内酯类药物的耐药性监测具有重要的临床意义。与阿奇霉素不同,目前还未见有Tp耐多西环素的报道,但作为疾病预防控制中心(CDC)推荐的治疗梅毒二线用药,已明确提出有必要对Tp多西环素耐药性进行监控。在《中国预防与控制梅毒规划(2010-2020年)》白皮书中,我国梅毒控制主要措施就包括提高梅毒实验室检测质量及加强梅毒筛查力度。目前,血清学试验作为梅毒诊断的主要依据,但均存在局限性。PCR作为一种有力的诊断手段,近十多年来,基于PCR的梅毒检测方法报道较多,该方法在检测梅毒下疳分泌物时,有较好的敏感性和特异性,而当检测血液及其他标本时,尽管有很好的特异性,但因敏感性较低,从而限制了该方法在临床上的应用,因而建立一种敏感性及特异性高的梅毒核酸检测方法十分必要。环介导等温扩增(LAMP)是近年来一种新型核酸检测技术,具有简单、高效快速、灵敏度高、特异性强的优点,可多种方式判定结果,并且能实现自动化,在疾病诊断和流行病学调查方面具有非常广阔的前景。研究目的本研究对湖南几个主要城市的Tp流行株进行分子分型并对23S rRNA和16S rRNA上耐药位点进行检测,揭示湖南地区的Tp流行型别及大环内酯类抗生素和多西环素的耐药现状,为本地区梅毒的监控和防治提供实验依据。建立Tp DNA的LAMP检测方法,并初步探索该方法在二期梅毒诊断中的应用价值。研究方法收集湖南部分城市(衡阳、长沙、岳阳、常德、郴州、永州)二期及潜伏梅毒患者2,253份全血样本,分别以pol A、tpp47、bmp和tp0319为靶基因对梅毒患者全血样本进行PCR筛选,任一靶基因阳性样本被认定为含有Tp DNA,将作为下一步研究样本。以arp、tpr和tp0548作为分型靶基因分别对筛选出的阳性样本进行扩增,确定arp基因重复序列数目;分析tpr基因RFLP型别;比对tp0548基因序列,确定型别。结合三个基因的型别确定全血样本中Tp DNA亚型。采用nPCR扩增筛选阳性标本中Tp 23S rRNA,23S rRNA扩增产物纯化后分别用限制性内切酶MboⅡ和BsaⅠ酶切,凝胶电泳观察结果;纯化产物测序比对。采用nPCR扩增筛选阳性标本Tp 16S rRNA,阳性产物纯化后测序,测序结果与Tp Nichols标准株比对。选取bmp作为靶基因,建立Tp-LAMP方法,扩增一系列10倍稀释的Tp Nichols株DNA,评价其灵敏度;以钩端螺旋体、伯氏螺旋体及常见临床菌株为对照,评价其特异性;检测二期梅毒患者及健康献血者全血样本,初步评价LAMP的临床应用。研究结果常规PCR筛选2,253例梅毒全血标本,靶基因pol A、tpp47、bmp和tp0319的阳性率分别为18.8%(423/2,253)、18.4%(415/2,253)、17.5%(395/2,253)和14.2%(321/2,253),共筛选出455例Tp DNA阳性标本。采用降落PCR从455例PCR阳性样本中扩增出203例arp基因,得到8种型别,其中以14个重复序列最为常见(62.6%,127/203);采用nPCR扩增tpr基因,获得385例阳性产物,经Mse I酶切后,RFLP分析tpr基因得到8种型别,其中以d型为主(62.1%,239/385);采用nPCR扩增tp0548基因,扩增出381例,PCR产物经测序后与公布的参考序列进行比对,得到4个型别,分别为f、a、c和g型。组合arp/tpr/tp0548均阳性的样本,188例样本能完全分型,可分为32个亚型,其中以14d/f亚型为主,占36.5%,其余的主要亚型分别为14a/f、14e/f、12e/f、12d/f、6d/f、11d/f、14j/f、8d/f、14d/a、14p/f、14d/c、14l/f、14e/a、14a/c、12d/a、5d/f、14b/f、6d/a、11o/f、12e/a、14d/g、14e/c、14a/a和14b/f。nPCR分别扩增23S rRNA和16S rRNA基因,455例PCR筛选阳性标本中分别扩增出400例23S rRNA基因,438例16S rRNA基因。经酶切和测序分析23S rRNA基因,有390例样本发生A2058G突变,其中二期梅毒占260例,潜伏梅毒占130例;未发现A2059G突变。16S rRNA扩增产物经测序分析后,尚未发现G1058C突变。建立Tp-bmp-LAMP方法,检测一系列10倍稀释的Tp Nichols DNA模板,灵敏度达4.3×100拷贝数/μL数量级,而传统bmp-PCR法检测限为4.3×102拷贝数/μL;检测对照菌株和健康者血液时Tp-bmp-LAMP法和常规bmp-PCR法均为阴性;在检测603例二期梅毒患者血液标本时,Tp-bmp-LAMP检出503例,敏感性、特异性分别为83.4%和100%。结论1)pol A,tpp47和bmp可作为核酸检测(NAT)的候选靶基因。2)2013~2015年湖南地区Tp流行株有32个基因亚型,其中以14d/f为主要流行型别。3)在湖南地区梅毒螺旋体流行株存在高频率23S rRNA基因A2058C点突变,临床上在治疗梅毒时,需谨慎使用大患内酯类抗生素。4)在湖南地区尚未发现Tp 16S rRNA基因G1058C点突变,多西环素可作为梅毒二线用药,但需密切随访,动态监测该突变位点。5)Tp-bmp-LAMP可与血清学结合用于二期梅毒的诊断。