论文部分内容阅读
J亚群禽白血病病毒(subgroup J avian leukosis virus, ALV-J)是一种最常见的外源性禽白血病病毒,自1999年我国首次从商品代肉鸡中分离得到之后,全国各地相继报道了ALV-J的感染。ALV的感染可能会造成鸡群生长迟缓、产蛋率和受精率等生产性能的降低、肿瘤发生,同时会造成感染鸡的免疫抑制,给我国养鸡行业造成了巨大的经济损失。然而目前还没有一种药物可以治疗或者控制AL,除了净化措施之外,也需要探索一种有效的抗病毒感染的方法。根据GenBank上ALV各亚群的三个主要编码基因gag、pol、env中的保守序列设计了5对特异性引物,分别用于检测蛋白酶PR、反转录酶RT、整合酶IN、表面蛋白基因gp85和穿膜蛋白基因gp37。通过RT-PCR技术扩增出5对引物的目的片段,回收PCR产物进行克隆测序,测序正确后的样品用于制备标准品质粒,10倍系列连续稀释后进行SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR,建立检测的标准曲线,同时绘制熔解曲线。结果显示,建立的5条标准曲线扩增效率为92.6%-100.5%,相应的相关系数均超过0.994。经过熔解曲线、特异性试验结果分析,设计的5对引物只能扩增出ALV病毒,特异性好；敏感性试验结果显示,可以检测得到一个数量级拷贝数的标准品质粒。说明建立的方法敏感性高,可以用于检测ALV-J病毒各基因mRNA转录水平的试验。试验通过构建重组腺病毒介导的RNAi以研究其在DF。1细胞上抑制ALV-J毒株HG03病毒复制的能力,应用建立的Real-time PCR方法检测病毒PR、RT、IN、gP85和gP37基因的mRNA转录水平和囊膜蛋白gp85的表达水平,经内参GAPDH校正后计算出mRNA相对表达量,与对照组相比判断其RNAi的抑制效果。首先根据GenBank中HPRS103毒株(Z46390.1)以及本实验室所测J亚型毒株HG03 gp85基因保守区域为靶序列,遵循siRNA设计规则,以及载体pHBAd-U6-RFP的要求,设计了三对寡核苷酸siRNA1、siRNA2和siRNA3。为方便连接载体,序列加入EcoRⅠ和BamHI酶切位点。干扰序列连接腺病毒载体后,与骨架质粒在HEK293细胞中进行同源重组,获得的3个重组载体分别命名为pAd-gp85-shRNA1 pAd-gp85-shRNA2和pAd-gp85-shRNA3,空载体为pAd-N。经测序鉴定正确后,制备重组病毒种子液并测定其滴度,分别达到1.26×1010PFU/mL、1.58×1010PFU/mL和1.26×1010PFU/mL,空载体滴度为2.0×1010PFU/mL。用构建好的重组腺病毒在DF-1细胞上进行RNAi效果的观察。首先测定重组腺病毒感染DF-1细胞的最佳感染复数(the multiplicity of infection,MOI)为500。其次,用500 MOI的重组腺病毒感染长成单层的DF-1细胞,8h后按1×103TCID50的量接种HG03病毒,接种后48h分别用建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法检测HG03各基因的mRNA相对转录水平。结果显示构建的重组腺病毒载体对HG03各基因都有抑制效果,对gp85基因抑制率为51.6%-82.0%,其中以pAd-gp85-shRNA2的抑制率最高,达82.0%；对其它4个基因的mRNA相对表达量也有所下调,不同的基因下调的幅度不同。IFA检测的结果显示,干扰组的荧光强度明显弱于阳性对照组的,而空载体对照组与阳性对照组的荧光强度没有明显区别,结果与Real-time PCR检测的相符。本研究成功构建了重组腺病毒介导的ALV-J HPRS103 gp85基因的RNAi载体,通过在DF-1细胞上进行的干扰试验结果证实,构建的重组腺病毒干扰载体可有效抑制ALV-J分离株HG03在DF-1细胞上的复制。