论文部分内容阅读
半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)是一种重要的经济鱼类,具有生长快等优点。Myostatin(MSTN),为肌肉抑素,又名生长转化因子8(GDF-8),属于转化生长因子β(TGF-β)家族成员。在哺乳类和其他物种中在主要在发育的和成年个体的骨骼肌中表达,起着抑制肌肉生长的作用。Follistatin(FST)为卵泡抑素,是一种富含半胱氨酸的糖基化单链多肽,它是对于包括MSTN在内TGF-β家族成员的一种重要的调节蛋白,对Myostatin起到抑制作用; Activin II型B受体(ActRIIB)是跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶受体家庭的一员, MSTN最先与ActRIIB结合形成复合体激活下游Smad传导蛋白,启动信号通路。本研究通过同源克隆和RACE(Rapid amplification of cDNA ends)技术获得FST和ActRIIB的全长cDNA,利用生物软件对基因进行了生物信息学的预测分析,并借助于实时荧光定量技术对两种基因不同组织和发育时期的时空表达进行了研究。1、半滑舌鳎的Follistatin基因的克隆及表达分析根据GenBank中已提交的鱼类Follistatin序列保守区域设计简并引物得到核心片段,通过RACE技术获得3’及5’末端,经拼接后得到半滑舌鳎FST cDNA全长1373bp,ORF为966bp,还包括16 bp的5’UTR,417bp的3’UTR。该基因编码了一个含有321个氨基酸的蛋白质前体,预测的分子量为35.5kD,等电点为8.12,在该蛋白的N末端包含一个由31个氨基酸残基组成的信号肽,是一种分泌型蛋白。蛋白质前体含有信号肽区域、N-端结构域、Follistatin结构域Ⅰ、Follistatin结构域Ⅱ、Follistatin结构域Ⅲ和C-端结构域。比较分析表明半滑舌鳎FST氨基酸序列与其他物种的FST同源性较高,其结构域Ⅰ和Ⅱ保守性更高,并富含保守的半胱氨酸残基。FST在半滑舌鳎10种组织中均有表达,其中在精巢、卵巢、脾脏中表达量较高;发育时期FST表达呈现出一定的波动性,与MSTN的表达量变化趋势相似并表现出一定的相互作用,暗示了FST在早期发育中发挥了作用。2、半滑舌鳎的ActRIIB基因的克隆及表达分析ActRIIB是Myostatin通路中重要的受体蛋白,通过同源克隆和RACE技术得到半滑舌鳎的ActRIIB基因cDNA全长2053bp,其中ORF序列为1539bp,还包括195 bp的5’UTR,325 bp的3’UTR。该基因编码512个氨基酸,蛋白质预测的分子量约为58.12 KD,等电点为5.80,N末端有一个24个氨基酸残基组成的信号肽,为跨膜蛋白。该蛋白含有明显的的丝氨酸/苏氨酸激酶激活位点签名序列,及胞外结构域,转膜结构域,丝氨酸/苏氨酸激酶结构域等三个重要结构域。在半滑舌鳎所有检测的10种组织中都不同程度上观察到了AcvRIIB的表达,但存在表达量上的差异; ActRIIB为母源性表达,与MSTN相比,在发育时期的表达低量且较为稳定。