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腰痛是全球范围内高发且复发率极高的一种公共健康问题,严重影响人们的工作效率和生活质量。由此带来的高额医疗费用,给个人和社会带来了巨大的经济负担。寻求一种安全有效且花费较少的腰痛治疗方法是目前医疗相关部门正在解决的问题。针刺作为一种安全、有效、无创的物理治疗方式被广泛推荐为腰痛的临床治疗方法。位于竖脊肌深层的腰部多裂肌在维持腰椎稳定性方面发挥重要作用。多裂肌形态的改变和功能的紊乱都会诱发或加重腰痛。因此,维持多裂肌正常的形态和功能是预防腰痛发生的关键。肌卫星细胞是骨骼肌损伤后再生修复的干细胞,肌卫星细胞的增殖是受损骨骼肌实现再生修复的关键。课题组前期对电针“委中”穴治疗多裂肌损伤所致腰痛模型的机制做了大量研究,发现电针“委中”穴可能通过调节血清中白细胞介素-17(IL-17)、血清肌酸激酶(CK)等,促进损伤多裂肌早期的再生修复,且以第4天的疗效最为明显。因此,本研究结合动物实验和细胞实验观察电针“委中”穴对损伤多裂肌再生修复的影响,以及再生修复过程中Integrinβ 1/ERK途径对肌卫星细胞增殖相关分子和细胞外基质(Extracell ular matrix,ECM)中胶原蛋白I(Collagen I)、基质金属蛋白酶2(Matrix Metalloproteinases,MMP2)表达的影响,揭示电针“委中”穴促进腰多裂肌损伤后再生修复的部分作用机制。实验一电针“委中”穴对大鼠腰多裂肌损伤后Collagen I、MMP2表达的影响目的:观察电针“委中”穴对大鼠腰多裂肌损伤后与骨骼肌增殖相关的成肌分化抗原(MyoD)、配对核转录因子7(Pax7)和ECM中Collagen I、MMP2表达的影响,揭示电针“委中”穴促进腰多裂肌损伤修复的部分作用机制。方法:SPF级雄性SD大鼠24只,随机分为正常组、模型组、电针组,每组8只,双侧腰4、5节段多裂肌局部注射0.5%的布比卡因建立多裂肌损伤的腰痛模型,电针组选取双侧“委中”穴进行电针治疗,频率2/100Hz,电流强度1-2mA,20min/次,1次/天,共针刺3次,正常组与模型组不给予针刺干预。第4天各组大鼠腹主动脉取血,制备针刺血清;收集损伤部位多裂肌,观察HE染色后多裂肌的形态学变化和Masson染色后胶原纤维的变化;WB检测MyoD、Pax7、Collagen I、MMP2的蛋白表达情况。结果:(1)肌肉注射0.5%的布比卡因导致多裂肌形态发生明显改变。(2)布比卡因注射后,多裂肌中胶原纤维数量增加;电针干预后胶原纤维数量减少。(3)Collagen Ⅰ、MMP2蛋白表达:与正常组比较,模型组CollagenⅠ、MMP2蛋白表达升高(P<0.01,P<0.05);与模型组比较,电针组Collagen Ⅰ蛋白表达降低(P<0.01)、MMP2蛋白表达升高(P<0.01)。(4)MyoD、Pax7蛋白表达:与正常组比较,模型组MyoD蛋白表达升高(P<0.01)、Pax7蛋白降低(P<0.01);与模型组比较,电针组MyoD、Pax7蛋白表达升高(P<0.05,P<0.01)。结论:电针“委中”穴可能通过良性调节ECM中Collagen Ⅰ、MMP2的蛋白表达,促进多裂肌增殖,实现损伤多裂肌早期的再生修复。实验二大鼠腰多裂肌卫星细胞的分离培养与鉴定目的:通过酶消化法建立一种多裂肌MSCs分离、纯化、培养及鉴定的有效方法。方法:SPF级雄性SD大鼠1只,分离获取腰4、5节段多裂肌,用I型胶原酶消化,使用差速贴壁法对腰多裂肌MSCs进行纯化处理,采用免疫荧光细胞化学染色检测Pax7、MyoD、MyHC的表达进行鉴定。结果:(1)形态学观察可见,分离、纯化得到的腰多裂肌MSCs形态为圆形,折光性强,培养一段时间后,细胞呈梭型。分离所得到的细胞具有一致的生长方式和形态特点。(2)免疫荧光细胞化学染色结果显示,分离得到的腰多裂肌MSCs在静止期表达Pax7、增殖期表达MyoD、分化早期表达MyHC。结论:应用酶消化法可以成功分离获得多裂肌MSCs,其相关特异性标志物表达为阳性,说明该方法是一种简单、高效的分离、培养、鉴定多裂肌MSCs的方法。实验三电针血清促进大鼠腰多裂肌细胞外基质重塑和肌卫星细胞增殖与ERK关系的研究目的:观察ERK在电针血清促进多裂肌MSCs增殖和ECM重塑过程中Collagen Ⅰ、MMP2表达的影响,探讨电针血清促进ECM重塑和MSCs增殖作用与ERK之间存在的关系。方法:以实验一中所制备的正常血清、模型血清、电针血清,另加设ERK抑制剂血清(电针血清+PD98059)为干预手段,培养实验二中分离鉴定所得的MSCs。共培养24h后,CCK-8检测各组MSCs的增殖能力;WB检测各组Collagen Ⅰ、MMP2、MyoD、Pax7、ERK的蛋白表达;RT-PCR检测 Collagen Ⅰ、MMP2 的 mRNA 表达。结果:(1)WB结果显示,与正常血清组比较,模型血清组ERK蛋白表达显著下降(P<0.01);与模型血清组比较,电针血清组ERK蛋白表达显著增加(P<0.01)。(2)MSCs增殖能力检测:①CCK-8:与正常血清组比较,模型血清组MSCs的增殖能力显著下降(P<0.01);与模型血清组比较,电针血清组MSCs的增殖能力显著上升(P<0.01),抑制剂血清组MSCs的增殖能力显著下降(P<0.01);与电针血清组比较,抑制剂组MSCs的增殖能力显著下降(P<0.01)。②WB检测MyoD、Pax7:与正常血清组比较,模型血清组蛋白表达显著下降(P<0.01);与模型血清组比较,电针血清组的蛋白表达显著增加(P<0.01),抑制剂血清组与模型血清组比较无差异(P>0.05);与电针血清组比较,抑制剂血清组蛋白表达显著下降(P<0.01)。(3)WB和RT-PCR检测ECM重塑:与正常血清组比较,模型血清组Collagen I蛋白、mRNA表达显著增加(P<0.01),MMP2 mRNA表达下降(P<0.01);与模型血清组比较,电针血清组Collagen I蛋白、mRNA表达显著降低(P<0.01)、MMP2蛋白表达增加(P<0.01);与电针血清组比较,抑制剂血清组Collagen Ⅰ蛋白、mRNA表达显著增加(P<0.01)、MMP2蛋白表达显著降低(P<0.01)。结论:电针血清通过促进ECM的重塑——增加MMP2的表达降解过多的Collagen Ⅰ,促进多裂肌MSCs的增殖,实现损伤多裂肌的再生修复;ERK参与了电针血清促进ECM重塑和MSCs增殖的过程。实验四电针血清促进大鼠腰多裂肌细胞外基质重塑和肌卫星细胞增殖与Integrinβ 1关系的研究目的:观察Integrinβ 1/ERK途径在电针血清促进多裂肌MSCs增殖和ECM重塑过程中Collagen Ⅰ、MMP2表达的影响,探讨电针血清促进ECM重塑和MSCs增殖作用与Integrinβ 1/ERK途径之间存在的关系。方法:同实验三,另设Integrinβ 1抑制剂血清组(电针血清+GRGDS)。干预24h后,采取 CCK-8 法检测 MSCs 的增殖能力;WB 检测 MyoD、Pax7、Collagen Ⅰ、MMP2、ERK、Integrinβ1 蛋白表达;RT-PCR 检测 Collagen Ⅰ和MMP2 mRNA 表达。结果:(1)WB结果显示,与正常血清组比较,模型血清组Integrinβ 1蛋白表达显著下降(P<0.01);与模型血清组比较,电针血清组Integrinβ 1蛋白表达显著增加(P<0.01)。(2)MSCs增殖能力检测:①CCK-8结果:与正常血清组比较,模型血清组MSCs增殖能力显著下降(P<0.01);与模型血清组比较,电针血清组MSCs增殖能力显著上升(P<0.01),抑制剂血清组MSCs增殖能力显著下降(P<0.01);与电针血清组比较,抑制剂组MSCs的增殖能力显著下降(P<0.01)。②WB检测MyoD、Pax7:与正常血清组比较,模型血清组蛋白表达显著下降(P<0.01);与模型血清组比较,电针血清组蛋白表达显著增加(P<0.01),抑制剂血清组与模型血清组比较无差异(P>0.05);与电针血清组比较,抑制剂血清组蛋白表达显著下降(P<0.01)。(3)WB和RT-PCR检测ECM的重塑:与正常血清组比较,模型血清组Collagen Ⅰ蛋白、mRNA表达上升(P<0.01),MMP2蛋白表达上升(P<0.01)、mRNA表达下降(P<0.01);与模型血清组比较,电针血清组Collagen I蛋白、mRNA表达显著下降(P<0.01),MMP2蛋白、MMP2 mRNA表达增加(P<0.01);抑制剂血清组Collagen Ⅰ蛋白、mRNA表达显著下降(P<0.01),MMP2蛋白表达无差异(P>0.05)、mRNA表达上升(P<0.01);与电针血清组比较,抑制剂血清组Collagen Ⅰ、MMP2 mRNA表达无差异,Collagen Ⅰ蛋白表达上升(P<0.01),MMP2蛋白表达下降(P<0.01)。(4)WB检测ERK:与正常血清组比较,模型血清组ERK蛋白表达显著下降(P<0.01);与模型血清组比较,电针血清组ERK蛋白表达显著升高(P<0.01),抑制剂血清组ERK蛋白表达显著下降(P<0.01);与电针血清组比较,抑制剂血清组ERK蛋白表达显著下降(P<0.01)。结论:电针血清通过促进ECM的重塑——增加MMP2的表达降解过多的Collagen Ⅰ,促进多裂肌MSCs的增殖,实现损伤多裂肌的再生修复;Integrinβ1/ERK途径参与了电针血清促进ECM重塑和MSCs增殖的过程。