研究背景临床上,炎症、Ⅲ度烧伤、体表肿瘤切除、急性创伤及慢性皮肤溃疡等,均可造成全层皮肤缺损。目前受损皮肤伤口的患病率较高,治疗是困难的,往往不尽如人意,给社会和经济带来负面的影响。皮肤伤口愈合是一个复杂的过程,涉及到许多类型的细胞和过程,如表皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞增殖,细胞迁移,细胞外基质(extracellular matrix,ECM)合成及伤口收缩。目前临床用于修复全层皮肤缺损的常用的方方法有自体游离皮片移植、皮瓣移植、异体皮/异种皮移植和人工替代物移植等方法。目前皮肤缺损的治疗,临床上还是以自体皮片移植为主,但植皮成活后在色泽、质地、瘢痕增生、供区愈合等方面存在一定弊端,且供体皮肤数量是受限的。随着组织工程学的不断发展,组织工程化皮肤的应用受到广泛的关注。目前,应用于临床的组织工程皮肤产品主要有人工表皮、人工真皮以及复合全层皮肤,但其对于伤口愈合往往存在一系列的问题,如创面收缩,瘢痕形成,与宿主的整合差,早期血管形成差。移植早期缺乏血管结构,不能及时建立血运是目前的组织工程化皮肤在临床应用受限、移植成功率不高的一个重要原因。特别值得关注的是,瘢痕,除了使受损组织不同程度丧失功能外,还有心理上的相关的问题如审美的创伤和痛苦,显著影响患者的生活质量。近几年来,采用组织工程的方法,使干细胞结合生物材料基质促进皮肤伤口愈合的研究,已获得越来越多的关注。然而,目前的研究存在着许多障碍,特别是如何采取合适的途径诱导皮肤再生同时避免瘢痕,促进血管形成。骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)已被报道在改善伤口的愈合方面具有重大的作用,其积极参与伤口的不同阶段愈合。BMSCs参与炎症的衰减调节过程,提高促血管生成因子分泌作用,重塑宿主的免疫,介导伤口愈合的细胞功能发挥,有利于组织再生和抑制纤维组织的形成。因而,BMSCs已被认为在细胞治疗方面是一个具有很大潜力的重要的成员,其在促进伤口愈合的同时能减少瘢痕形成,提高创面血管化。生物材料支架是组织工程研究的桥梁,为细胞的增殖分化、营养交换、新陈代谢等生理活动提供必需的空间场所,在组织的构建过程中发挥着重要作用。因此,生物材料支架的优劣,不仅影响细胞的生物学行为和培养效果,而且决定着细胞移植后能否很好的适应、结合宿主,从而影响到受损皮肤最终的修复效果。石墨烯泡沫(graphene foam,GF),具有三维多孔结构,最近在组织工程领域中的应用受到广泛关注。三维石墨烯泡沫(three-dimensional graphene foam,3D-GFs),具有单层连续的多孔结构。有报道研究表明,3D-GFs的孔隙率高达99.5±0.2%,具有100至300μm的孔径,可能具有较高的伤口的水分保持能力。因此,该3D-GFs结构是一种很有前途的候选细胞支架,因为它可能总合形状、化学和电学的特性在同一支架中的发挥作用,为皮肤组织再生提供一个适宜的环境,优于传统的惰性生物材料。研究证实二维石墨烯的独特性质可诱导干细胞优先分化为特定的谱系,3D-GFs亦可作为具有生物相容性的导电支架,诱导神经干细胞的分化增殖,且能诱导BMSCs成骨分化。引起临床兴趣的是,3D-GFs能在体外促使细胞增殖与分化,其多孔三维结构可提供三维微环境,能模拟细胞体内皮肤伤口愈合过程。此外,在伤口感染治疗方面,石墨烯材料表现出较强的抗菌和抗真菌作用。石墨烯泡沫的上述特性,为选择其作为组织工程细胞支架提供了新的治疗思路。在这项研究中,我们假设骨髓间充质干细胞与石墨烯泡沫的生物力学和生化特征协同,能改善创伤愈合环境,促进早期血管形成和减少瘢痕。基于以上研究背景,本研究将从大鼠骨髓提取间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)进行分离、培养和扩增,以3D-GFs做为细胞支架,负载BMSCs,移植到皮肤受损创面,进行创面愈合、血管化和瘢痕的研究。研宄目的检测3D-GFs支架的生物相容性;观察3D-GFs和BMSCs在创面愈合中作用;并进一步观察3D-GFs和BMSCs在创面血管化和减轻瘢痕方面的效应;最终为皮肤伤口治疗提供新的思路和途径,为其在组织工程中的应用奠定基础。方法1.取成年雄性SD大鼠股骨、胫骨骨髓腔内细胞,采用全骨髓培养法进行分离培养扩增。取第3代骨髓间充质干细胞,使用流式细胞仪检测干细胞表面抗原标志物CD54、CD73、CD45和CD34表达,同时进行成脂、成骨能力检测,倒置显微镜下观察细胞形态变化,并进一步使用油红染色、茜素红染色观察定向诱导的效果。2.采用化学气相沉积法合成3D-GFs,使用扫描电显微镜和金相显微镜观察样品表面形貌,能谱仪和拉曼光谱仪,进一步进行样品材料成分分析。3.将大鼠BMSCs分别接种于3D-GFs、聚苯乙烯基板(Tissue Culture Polystyrene,TCPS),使用MTT法、LDH法、BrdU掺入法检测细胞增殖情况。并同时采用免疫荧光法检测大鼠BMSCs在3D-GFs上生长情况。4.动物实验:将体重220-300g的雄性SD大鼠随机平均分为三组对照组、GF组和GF加MSCs组。在大鼠背部制造全层皮肤缺损切口,所有伤口均用透明敷料覆盖,并使用弹性绷带加以固定。将动物关在单独的笼子里,允许自由采食,每天观察实验大鼠的创面变化。术后第3d、7、10和14d,采用CO2吸入法处死大鼠,实时定量 RT-PCR 检测 VEGF、bFGF、TGF-β1,TGF-β3,α-SMA 的表达;术后 14d,行HE染色组织学染色检测再生皮肤厚度;术后7、14d进行各组再生皮肤可溶性胶原含量的测定。待各组皮肤伤口愈合后,取新愈合皮肤进行水化作用、经皮水分流失、抗拉力强度和弹性位移测定。结果1.采用全骨髓培养法成功分离出BMSCs,第5d发现细胞呈集落样生长,以梭形细胞为主,生长旺盛,连续传代4代,未见有细胞明显衰退。流式细胞仪检测结果显示表达CD54、CD73,其阳性率分别为98%和97%;而造血干细胞相关标志CD45、CD34阳性率仅为1%、1.5%。成脂、成骨分化诱导培养后,油红染色、茜素红染色均为阳性。2.采用化学气相沉积法成功合成了 3D-GFs,扫描电镜和金相显微镜观察,其具有单层连续多孔结构,孔隙率为99.7±0.3%,孔径大小100-350μm,骨架宽度40-100μm。拉曼光谱仪测定结果确定合成的GF含有单层和少层的石墨烯,能谱仪测试结果表明GF的表面碳为主要元素,未能明显测出镍元素。3.MTT法和LDH法检测表明,与TCPS相比,3D-GFs对大鼠BMSCs的增殖无显著性差异(P>0.05)。BrdU掺入法结果分析表明,从第5d开始,3D-GFs对大鼠BMSCs增殖活力显著高于TCPS(P<0.01)。同时免疫荧光共聚焦显微镜显示大鼠BMSCs在3D-GFs具有良好的细胞粘附,能形成三维网络。4.伤口面积和愈合时间分析显示,GF组与对照组的创面愈合比较无显著性差异(P>0.05)。移植后3d,与其他2组相比,GF加MSCs组伤口面积明显缩小(P<0.01),伤口愈合时间亦明显缩短(P<0.01)。血管化VEGF和bFGF的mRNA水平检测显示GF组与对照组相比,没有表现出显著差异(P>0.05);从3d到14d,GF加MSCs组表达显著高于对照组(P<0.01)和GF(P<0.01)组。GF加MSCs组TGF-β1水平与其它2组相比明显降低(P<0.01)。TGF-β3的表达在3组是一个相反的趋势,并在GF加MSCs组的表达水平明显高于其他2组(P<0.01)。αα-SMA mRNA水平随着时间的推移,与TGF-β1的表达水平调节趋势相似。GF组TGF-β1(从10d),TGF-β3(从第10d),和α-SMA(从7d)与对照组相比,存在显著性差异(P<0.05)。皮肤厚度、可溶性胶原含量、抗拉力强度和弹性位移测定,GF加MSCs组表达显著高于对照组(P<0.01或P<0.05)和GF组(P<0.01或P<0.05),GF组与对照组相比无显著性差异(P>0.05)。水化作用、经皮水分流失测定,GF加MSCs组优于GF组(P<0.01或P<0.05)和对照组(P<0.01),GF组优于对照组(P<0.05)。结论1.全骨髓贴壁培养法可成功分离扩增大鼠BMSCs,表达MSCs表面抗原,具有多项分化潜能。2.采用化学气相沉积法能合成的3D-GFs,其具有单层连续多孔结构,且杂质少,缺陷少,结构稳定。3.3D-GFs对BMSCs无细胞毒作用,相容性高,且能促进细胞增殖。4.3D-GFs负载BMSCs能上调VEGF和bFGF,促进血管的形成,上调TGF-β1和α-SMA,下调TGF-β3,具有抗瘢痕作用。5.3D-GFs负载BMSCs能明显促进皮肤伤口愈合,提高愈合皮肤质量。6.3D-GFs能一定程度上改善愈合皮肤质量,减轻创面瘢痕的形状。