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目的:本课题通过对中药材炮制品DNA快速提取、快速PCR扩增以及重金属含量快速检测技术进行研究,建立了中药材真伪及重金属含量的快速质量评价体系中的中药材真伪鉴别及重金属含量检测,为满足中药鉴别现场运用系统的快速、简单、低毒、高效、灵敏等要求提供技术支撑。 方法:1.以氢氧化钠,1%PVP40和1%TritonⅩ-100配制成碱裂解缓冲液,Tris-HCl为中和液,经加热裂解和中和两步对地黄酒炙品、槐米炒制品以及加入辅料的炮制品进行DNA提取并进行PCR扩增。在该提取方法的基础上,选择试剂盒法和Chelex-100法对槐米炒制品DNA进行纯化,用通用引物进行PCR扩增。2.通过对西红花及其常见掺伪品的叶绿体基因片段psbA-trnH测序和比对分析,找出序列差异,针对差异碱基设计特异性引物,构建PCR扩增反应体系,通过优化PCR反应退火、变性温度及时间,减少循环数等条件,选择高效的DNA聚合酶,缩短PCR反应时间,在PCR产物中加入SYBR GreenⅠ荧光染料,代替凝胶电泳步骤。3.使用不同金属离子与探针反应,确定两种探针的选择性。使用不同浓度铜离子溶液与两种探针反应,根据铜离子浓度与荧光强度值作出标准曲线,测定药材粉末的待测液与Probe混合液的荧光强度值,计算出药材粉末中金属离子含量。同时通过ICP-MS和紫外分光光度法分别测定该批次药材中的铜离子含量与总重金属含量与探针测量结果比较。 结果:1.优化碱裂解法可简单快速的提取出地黄酒炙品、醋炙延胡索、酒炙当归、盐炙补骨脂、麸炒苍术等药材的DNA。槐米炒制品提取DNA浓度为420.61士123.91μg·μL-1,但槐米炒制品在炒制温度高、时间长的情况下,很难扩增出明显PCR条带,通过使用5% Chelex-100树脂纯化后即可获得明显扩增条带。2.建立了基于psbA-trnH序列的西红花快速真伪鉴别体系,优化后的PCR反应条件为90℃预变性1min,90℃变性5s,58℃延伸5s,26个循环。在PCR反应产物中加入染料SYBR GreenⅠ,西红花正品出现强烈绿色荧光,而伪品无荧光。3.荧光探针B是针对于Cu2+的特异性荧光探针。Probe B与不同浓度铜离子混合后,铜离子浓度在0.6-2.4 mg/L范围内显绿色荧光,当浓度大于2.4 mg/L时,绿色荧光淬灭。在0-2.4 mg/L范围内铜离子浓度与荧光强度比值的标准曲线为y=6.4395x-6.0247,根据该曲线得出的铜离子浓度与ICP-MS测出的铜离子浓度进行比较,作出曲线y=4.8471x-0921,据此可以得出药材中的铜离子含量。4.荧光探针A是针对与总重金属离子的含量测定的荧光探针。Probe A与不同浓度铅离子混合后均显蓝色荧光,在0-4.0 mg/L范围内铅离子浓度与荧光强度比值的标准曲线为y=0.1165x+0.5413,根据该曲线得出的铅离子浓度与紫外分光光度法测出的总重金属含量进行比较,作出曲线y=1.2335x+28.355,据此可以得出药材中的铜离子含量。 结论:优化碱裂解法能够快速、安全的提取中药材炮制品的DNA;位点特异性PCR方法可以简单快速的鉴别药材真伪及其掺伪品;荧光探针技术可以快速的测量出药材粉末中铜离子与总重金属的含量,测量过程简便、快速。通过以上方法可以简便、快速、直观的对药材真伪以及质量进行鉴别。