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研究背景乳腺癌(Breast cancer)位居女性恶性肿瘤的第1位,是影响女性生命健康的首要因素。目前药物靶向治疗乳腺癌的有效性取决于免疫组织化学检测癌细胞中雌激素受体(ERs),孕酮受体(PRs)和人表皮生长因子受体-2(HER-2)的表达。三阴性乳腺癌(TNBC)则缺乏这三种特定的作用靶点,是当前临床治疗中面临的巨大挑战[1]。多项研究表明在某些食物中发现有防癌抗癌作用的天然活性物质。如十字花科蔬菜作为可能降低癌症风险的食物被广泛使用,异硫氰酸盐(ITCs)可能是其防癌活性的主要物质基础[2]。苯基丁基异硫氰酸酯(4-phenybutyl isothiocyanate,PBITC)是一种合成的异硫氰酸盐,有研究报道,PBITC明显降低化学致癌物N-亚硝基双(2-氧代丙基)胺(N-nitrosobis(2-Oxopropyl)amine,BOP)诱导的胰管导管异位症和胰腺癌的发生,肺腺瘤和腺癌也显著降低,但并未见深入研究其机理的报道[4]。微管是细胞骨架的中心成分,由α-和β-微管蛋白组成,具有高度动态的结构,在细胞的各种基本功能中起着重要的作用。微管动力学的破坏可以诱导细胞周期停滞在G2/M期,导致有丝分裂轴异常并触发凋亡。影响微管功能的试剂可以根据其对微管装配的影响分为两类。第一类是微管稳定剂(解聚抑制剂),可以稳定微管,增强微管聚合,并诱导细胞中微管束的形成。第二类是微管去稳定剂,可以抑制微管聚合并减少细胞中微管的长度。两种类型的微管剂均通过直接结合微管蛋白来改变微管动力学。如紫杉醇和长春新碱等能够破坏微管,抑制细胞增殖和诱导细胞程序性死亡,在癌症临床治疗中应用广泛[5]。BAG3是BAG共伴侣家族中唯一受应激诱导和含有自噬激活结构域(WW)的成员,在调节细胞发育、运动、自噬、凋亡,介导细胞对应激的适应性反应以及肿瘤转移方面起关键作用[6]。BAG3的高表达,可能是化疗耐药的原因之一[7]。本课题初步探索PBITC诱导三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231发生自噬、周期阻滞及凋亡的效应和分子机理,为评价其成药性提供理论参考。研究内容和结果:1.PBITC诱导MDA-MB-231细胞发生自噬、周期阻滞和凋亡采用免疫印迹、流式细胞术、免疫荧光等方法检测PBITC对MDA-MB-231细胞自噬、周期和凋亡的影响,并确定自噬类型。发现低剂量PBITC诱导MDA-MB-231细胞发生自噬和G2/M期阻滞,推测PBITC诱导的自噬类型可能是伴侣辅助选择性自噬(CASA)。高剂量处理细胞时诱导细胞凋亡。2.PBITC干预乳腺癌细胞后的比较蛋白质组学分析用比较蛋白质组学方法检测PBITC对MDA-MB-231全细胞蛋白质表达的影响,寻找功能集中的差异蛋白群。发现微管蛋白、热休克蛋白、泛素化蛋白、锌指蛋白、转录因子等发生明显变化,多数蛋白降低幅度超过50%。然而BAG3和Hsp B8却明显升高。3.PBITC抑制微管蛋白解聚激光共聚焦显微镜观察微管形成情况,亚细胞分离后免疫印迹检测分析PBITC对微管聚集的影响,计算机分子对接预测PBITC与微管蛋白的结合,发现PBITC抑制微管蛋白解聚。4.PBITC激活BAG3-Hsp B8复合物与微管结合免疫共沉淀后蛋白免疫印迹检测,分析BAG3、Hsp B8、TUBA、Ub蛋白之间的相互作用,发现BAG3与Hsp B8相互作用,Hsp B8与TUBA相互作用,与Hsp B8相互作用的TUBA可能为二聚体并伴随泛素化修饰的状态。结论本研究发现PBITC诱导三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231发生自噬、G2/M期阻滞和凋亡呈时效性和量效性。首次发现并初步证实PBITC抑制微管蛋白解聚,这可能是PBITC诱导周期阻滞和凋亡的原因。首次发现并初步证实PBITC激活BAG3-Hsp B8复合物,该复合物可能与聚合并伴随泛素化状态的微管蛋白结合,提示PBITC可能激活了BAG3介导的CASA,并以微管蛋白为底物。为进一步评价PBITC的成药性提供了理论参考。