研究背景人巨细胞病毒(Human Ctyomegalovirus, HCMV)是感染发育中的胎儿最常见的病毒,在发展中国家和低收入的群体中广泛传播,也是导致儿童出生缺陷主要因素之一。目前,HCMV先天性感染已经成为智力低下和学习困难的主要病因。为探讨HCMV先天性感染致学习记忆功能障碍的机制,课题组从2002年开始,成功的建立HCMV先天性感染的系列鼠模型。早期的预实验研究表明,HCMV先天性感染子代鼠出现显著地空间学习记忆障碍,其机制不明确。为探讨HCMV先天性感染对子代大鼠空间学习记忆的影响,本研究拟建立先天性HCMV感染的Sprague Dawley(SD)大鼠模型,应用病理、神经行为学检测方法(Morris水迷宫、悬吊和旷场实验等),探讨HCMV先天性感染对子代大鼠空间学习记忆和运动功能发育的影响及病理机制；应用在位场电位记录的方法,检测HCMV先天性感染对仔鼠海马DG区、CA1区突触可塑性的影响；应用免疫组化和蛋白电泳技术等技术,分析仔鼠海马组织中触发突触可塑性的NMDA受体亚单位的表达情况,检测诱导和维持突触可塑性的关键蛋白、分子CaMKⅡ和Ca2+的水平,从海马损伤的病理、突触可塑性特性改变的神经生理学、以及影响突触可塑性的蛋白、分子水平变化角度,阐明HCMV先天性感染致大鼠海马空间学习记忆损伤的机制,对防治儿童感染HCMV而导致神经残疾具有重要的理论意义和临床价值。第一部分HCMV先天性感染大鼠模型建立及空间学习记忆等神经行为的检测目的建立HCMV先天性感染的SD大鼠模型,探讨HCMV先天性感染对子代大鼠空间学习记忆、运动和情绪发育的影响。方法将40只12周龄的SPF级SD大鼠按雌雄3：1合笼交配,妊娠第4天(实验组)腹腔内接种HCMV病毒悬液0.5m1/早,对照组同期接种等量的HELF细胞悬液。检测胎鼠脑组织病毒颗粒,免疫组化检钡(?)HCMVpp65等特异性抗原。分别对实验组和对照组生后第4周的仔鼠,进行空间学习记忆(Morris水迷宫)、运动功能(悬吊试验、斜坡实验、倾斜板实验、不自主运动和自主运动)和情感行为(拒俘反应试验和旷场实验)的检测。统计处理使用SPSS20.0软件,测定结果以x+s表示,应用SPSS20.0统计软件对实验数据进行处理,测定结果以x+s表不,Morris水迷宫空间学习记忆测试数据采用广义混合线性模型进行统计分析,等级资料采用秩和检验。计数资料用x2检验,作图用Origin8.0,显著性水准α取0.05,双侧。结果(1)实验组孕鼠每窝产仔数、一周内仔鼠的死亡率和海马HCMV病毒分离阳性率均显著高于对照组(P<0.05)。病理上,实验组子代大鼠皮层出现典型神经细胞空泡变性,海马齿状回细胞带细胞数有所减少,组织结构稀疏,排列紊乱。子代海马神经元细胞培养物中成功检测到HCMV早期感染标志物(主要即可早期抗原,MIE),同时也找到HCMV病毒活动性感染的标志物pp65,证实HCMV先天性中枢系统感染模型的建立。(2)空间学习记忆结果(Morris水迷宫)：广义混合线性模型模型有统计学意义(F=120.113,P=0.000),实验组第1-4天逃避潜伏期分别(d1：96.33±17.29；d2：74.35±12.61；d3：56.63±16.50；d4：41.02±6.83)比对照组第1-4天逃避潜伏期(dl：48.37±12.10；d2：31.40±9.04；d3：23.38±9.21；d4：17.13±3.99)延长,两组间差异存在显著性(F=499.473,P<0.05),四天之间结果差异存在显著性(F=123.623,P<0.05)采用广义混合线性模型检验,考虑速度为协变量,模型有统计学意义(F=108.163,P=0.000),实验组第1-4天的总路程(dl：14.34±6.55；d2：10.47±3.92；d3：8.35±4.10；d4：6.45±3.63)高于对照组1-4天的总路程(d1：7.66±1.89；d2：5.04±2.32；d3：4.12±1.91；d4：3.05±1.59)(F=440.167,p<0.01；),四天之间结果差异存在显著性(F=121.658,P<0.05)(图5)。Morris水迷宫空间探索能力比较,实验组穿越平台次数4.21±1.44,显著低于对照组7.50±1.72(t=-7.182,P<0.01)；实验组目标象限游泳时间占总时间的百分数(26±4)%也低于对照组(47±5%),差异具有显著性(t=15.487,P<0.01)。上述Morris水迷宫系列结果表明：HCMV先天性感染导致子代出现空间学习记忆功能的下降。实验组第1-4天游泳速度分别为(dl：16.38±4.59；d2：16.63±7.14；d3：19.16±8.00；d4：18.26±8.62)与对照组第1-4天游泳速度(d1：14.89±6.38；d2：14.17±4.97；d3：15.19±6.34；d4：15.62±7.88)比较,两组间差别存在显著性(F=7.211,p=0.008<0.05；方差分析)。说明HCMV先天性感染大鼠存在运动功能的下降。(3)运动功能测试的结果：实验组大鼠悬吊实验得分(1.444±0.70)显著低于对照组(2.61±0.70),差异均具有统计学意义(Z=-3.789,P<0.001)；实验组大鼠斜坡实验评分(1.99±0.20)显著低于对照组(4.244±0.14),差异具有统计学意义(t=17.821,P<0.001)；倾斜板实验,实验组在倾斜板上的停留时间(46.34+3.28)s低于对照组(63.33+4.69)s,差异有统计学意义(t=6.286,P<0.001)。不自主运动：两种仔鼠均有不同程度不自主运动,实验组得分(7.50±1.05)较对照组(9.33±1.21)低,差异存在统计学意义(t=2.803,P<0.05)。自主运动：实验组自主运动的次数(18.33±0.84)显著低于对照组(29.17±1.22)差异具有显著性(t=14.657,P<0.001。上述结果表明HCMV先天性感染可导致子代出现运动能力受损。4)情绪行为发育的结果：实验组拒俘反应性试验得分(3.56±0.92)显著低于对照组(5.28±0.83),差异均具有统计学意义(Z=-4.248,P<0.001,两独立样本非参数检验)。旷场试验,实验组站立次数(30.28±3.44)显著低于对照组(30.28±4.11),差异具有显著性(t=-12.630,P<0.05)；跨格子数实验组(80.56±3.16)与对照组(84.94±3.70)差异无显著性(t=1.815,P=0.129)。结果表明HCMV先天性感染可影响子代情绪行为的发育。结论(一)成功的建立了HCMV先天性感染的SD大鼠模型,通过病理、电镜、病毒分离和特异性抗原检测等途径证实模型的可靠性。(二)神经行为学检测证实：HCMV先天性感染大鼠模型,子代出现显著地空间学习记忆功能下降,同时伴有运动和情绪行为发育的异常,与临床HCMV先天性感染患者的表现类似。(三)皮层液化坏死、海马结构紊乱和颗粒细胞减少等病变是导致子代大鼠出现空间学习记忆和运动动能下降以及情绪发育异常的主要病理学原因。(四)本研究虽然提出了CMV在神经细胞中潜伏感染和再激活是导致学习记忆下降的病因,但是推论是基于国内同类研究的结果分析总结而得出的,缺乏直接依据,需要进一步深入研究,寻找潜伏感染和再激活的依据,为临床治疗HCMV无症状感染患者提供理论基础。第二部分HCMV先天性感染对仔鼠海马DG区、CA1区LTP/DP的影响目的海马DG区、CA1区的突触可塑性是反应空间学习记忆功能的一个重要指标。为明确HCMV先天性感染致子代大鼠空间学习记忆损伤的机制,本研究拟采用在位场电位记录方法,探讨HCMV先天性感染对子代大鼠海马DG和CA1区LTP/DP特性的影响。方法取SPF级8周龄的SD大鼠共40只按雌、雄,3：1配对,将受精鼠随机分为2组(实验组、对照组),每组15只,在妊娠第4天分别腹腔内接种1×10-6TCID50HCMV病毒悬液0.5ml/♀,对照组同期分别接种等量的HELF细胞上清液。在仔鼠出生后60～90天,用神经电生理的方法(在位场电位记录方法),检测HCMV先天性感染对海马DG区输入/输出曲线(I/O曲线)、双脉冲反应(PPF)、长时程增强(LTP)和去增强(DP)的兴奋性突触后电位(EPSP)和群峰电位(PS)。同时选择海马CA1区长时程增强(LTP)和去增强(DP)的兴奋性突触后电位(EPSP)和群峰电位(PS)。统计学处理：比较实验组和对照组组间的差异用重复测量资料方差分析,同一重复水平两组间做两样本t检验。配对设计数据两组间比较采用配对t检验,显著性水准α取0.05,双侧,作图用Origin8.0。结果(一)海马DG区实验结果海马DG区I/O曲线结果显示：采用重复测量资料方差分析,和对照组相比,HCMV先天性感染组的EPSP幅度明显(1.57±0.41)(n=7)低于对照组(2.16±0.72)(n=7),差别有统计学意义(F=39.004,P<0.05),表明HCMV先天性感染可抑制DG区颗粒细胞的基础突触传递效能。同时和对照组相比,先天性HCMV系统感染组PS幅度(4.8±0.20)(n=7)亦显著低于对照组(7.1±0.26)(n=7),差别有统计学意义(F=39.004,P<0.05)。结果表明先天性HCMV中枢神经系统感染损伤了DG区颗粒细胞的共同发放。采用配对t检验,双脉冲易化的峰值实验组为175.62±14.24,较对照组(224.50±12.42)显著减低,这表明HCMV先天性感染可以导致子代大鼠海马DG区的双脉冲反应显著减弱(t=7.199,P<0.01,)。DG区LTP (EPSP)的结果：采用重复测量方差分析,对照组LTP(EPSP)幅值(137.14±7.85)%,实验组LTP (EPSP)幅值为(124.26士4.95)%,和对照组比较,HCMV先天性感染组显著高于对照组(F=58.622,P<0.05)。DP幅值比较也采用重复测量方差分析,满足球形假设,DP对照组DP幅值为(88±5)%(EPSP),实验组为(91±2)%,(F=4.463,P=0.055)DG区LTP (PS)的结果：采用重复测量资料方差分析,对照组LTP(PS)幅值(234.92±30.17)%,实验组EPSP (PS)幅值为(136.84+12.37)%,和对照组比较,HCMV先天性感染组显著高于对照组(F=352.114,P<0.05)。对照组DP(PS)幅值为(72±6)%,实验组为(91±5)%,(F=130.947,P<0.05)。这表明HCMV先天性感染明显损伤了大鼠海马DG区的LTP/DP诱导,并且对PS的LTP/DP诱导的损伤尤为严重。(二)海马CA1区LTP/DP的结果采用重复测量资料的方差分析,对照组的LTP (EPSP)幅值为(151.17士11.3)%,实验组LTP (EPSP)幅值为(124.63士6.1)%,和对照组比较,HCMV先天性感染幅值与对照组有显著性差异(F=133.737,P<0.05)。对照组的DP(EPSP)幅值为(88±9)%,实验组DP(EPSP)幅值为(98±2)%,差异有显著性(F=7.064,P<0.05)。方法同上,对照组的LTP (PS)幅值为(235±26)%,和实验组相比(168±17)%,(PS：F=127.624,P<0.05)对照组的的DP (PS)幅值为(82±9)%(PS),实验组DP(PS)幅值为(83+7)%(PS),差别无显著性(PS：F=0.796P>0.05)。这表明HCMV先天性感染明显损伤了大鼠海马CA1区的LTP/DP诱导,并且对EPSP的LTP/DP诱导的损伤尤为严重。结论(一)HCMV先天性感染影响子代大鼠海马DG区基础突触传递效能和颗粒细胞的共同发放,影响突触可塑性的调节,海马结构紊乱、颗粒细胞减少是导致DG区基础突触传递效能下降及颗粒细胞发放能力的减低结构基础。(二)HCMV先天性感染子代大鼠出现CA1区和DG区LTP/DP的诱导和维持异常,形成突触可塑性调节障碍。(三)本研究重点探讨了影响大鼠空间学习记忆的突触可塑性机制,对海马DG区和CA1区LTP/DP的诱导和维持能力进行检测,结合第一部分病理学改变的结果,认为突触可塑性特性的改变可能是导致子代大鼠空间学习记忆能力下降的重要机制。(四)不足之处：本研究仅探讨了LTP,未能对海马各区LTD的变化进行检测,未来的研究中应结合LTP/LTD的总体变化情况,较为全面的研究HCMV先天性感染对突触可塑性范围的影响。第三部分NMDA受体亚单位及相关蛋白(CaMKⅡ)和分子(Ca2+)水平的改变对突触可塑性的影响目的钙离子内流介导的,有CaMKⅡ参与的NMDA受体激活,是学习记忆和突触可塑性的基础。为探讨HCMV先天性感染导致突触可塑性改变和学习记忆下降的原因,本研究拟对HCMV先天性感染的SD大鼠子代海马NMDA受体亚基、CaMKⅡ和Ca2+进行检测。方法建立HCMV先天性感染的SD大鼠模型,对实验组和对照组子代大鼠分别进行以下检测：(1)免疫组化定位检测子代大鼠海马DG区和CA1区NMDA受体(GluN1,GluN2A和GluN2B)的表达水平。、Vest-blotting检测海马组织中的(GluN1, GluN2A和GluN2B)表达水平。(2)免疫组化的方法检测海马神经细胞的CaMKⅡ表达水平；(3)Fura-2荧光法测定海马神经细胞Ca2+浓度。结果(1)子代海马DG区NMDA受体免疫组化检测结果显示：实验组DG区GluN1(0.168±0.032), GluN2A (0.176±0.016), GluN2B (0.123±0.013)均低于对照组GluN1(0.288±0.027), GluN2A (0.235±0.033), GluN2B (0.184±0.023),差异有统计学意义(GluN1:t=6.656, P<0.01;GluN2A:t=3.817, P<0.01; GluN2B:t=6.842, P<0.01)。。子代海马CA1区NMDA受体免疫组化检测结果显示：实验组CA1区GluN1(0.220±0.017), GluN2A (0.215±0.024), GluN2B (0.17±0.021)均低于对照组GluN1(0.320±0.033), GluN2A (0.273±0.024), GluN2B (0.280±0.023),差异均有统计学意义(GluN1:t=8.819, P<0.01; GluN2:t=4.271, P<0.01; GluN2B: t=8.582,P<0.01)。研究结果表明,CA1区和DG区,均存在NMDA受体亚基表达水平的显著下降。子代海马组织的NMDA受体蛋白印迹表达结果显示,实验组海马GluN1(0.463±0.042),GluN2A (0.156±0.020), GluN2B (0.174±0.013)均低于对照组GluN1(0.686±0.037),GluN2A (0.248±0.020), GluN2B (0.233±0.033),差异具有显著性(GluN1:t=9.889, P<0.01;GluN2:t=19.916, P<0.01; GluN2B: t=4.116, P<0.01)。研究结果表明,HCMV先天性感染的子代大鼠海马组织中NMDA受体亚基的表达水平显著下降。实验组子代大鼠海马CaMKⅡ免疫阳性细胞平均光密度值(0.2184+0.026)低于对照组(0.3323±0.025)差异有统计学义(t=8.184,P<0.01),证实HCMV先天性感染导致子代海马神经CaMKⅡ表达水平减低。实验组子代海马神经细胞钙离子浓度为227.64±10.70,显著高于对照组子代海马神经细胞钙离子浓度(130.68±6.24),差异具有统计学意义(t=21.768,p<0.05)。说明HCMV先天性感染导致子代海马神经细胞钙离子浓度升高。结论(一)HCMV先天性感染子代海马组织和CA1区、DG区等,都存在NMDA受体亚单位(GluNl, GluN2A, GluN2B)的表达水平下降,伴有GluN1/GluN2比例失衡,可能是导致LTP及空间学习记忆功能受损的机制之一。(二)HCMV先天性感染致子代大鼠海马组织中CaMKⅡ的表达水平降低,CaMKⅡ水平减低是导致突触可塑性减低的重要原因,也是空间学习记忆功能损伤的一个重要原因。(三)HCMV先天性感染组子代大鼠海马神经细胞出现钙代谢异常。钙代谢紊乱可能是导致海马及皮层神经元细胞水肿、坏死和空间学习记忆功能下降以及突触可塑性范围缩小的一个重要机制。(四)不足之处：本研究仅重点探讨了影响LTP维持和诱导的核心受体、蛋白和分子,其他相关受体如AMPA受体、CaM以及其他突触后膜的调节分子和蛋白需要进一步深入研究。总结本研究通过成功建立HCMV先天性感染的SD大鼠模型，应用Morris水迷宫等神经行为学检测，发现感染组子代大鼠出现空间学习记忆功能下降，伴有运动、情感行为等的功能发育异常。为探讨HCMV先天性感染仔鼠空间学习记忆功能损伤的机制，对影响海马空间学习记忆功能的重要因素，即海马DG区、CAl区的突触可塑性LT/DP进行检测，证实HCMV先天性感染可导致子代大鼠海马CAl和DG区突触可塑性下降，尤其是损害了LTP的诱导。同时为了初步探讨突触可塑性改变的具体机制，对海马CAl区、DG区NMDA受体的核心亚基GluN1、GluN2A和GluN2B、以及诱导和维持突触可塑性的主要蛋白(CaMKⅡ)和分子(海马神经细胞的钙离子浓度)进行检测，结果证实HCMV先天性感染大鼠海马组织、CAl区和DG区，均存在NMDA受体亚单位GluNl、GluN2A和GIuN2B表达水平的显著下降。海马神经细胞内钙离子浓度升高，CaMKⅡ表达水平下降。本研究证实：(一)HCMV先天性感染子代大鼠脑组织出现皮层液化坏死、空泡变性和海马结构紊乱等病理改变，行为学检测发现空间学习记忆功能下降，伴有运动和情绪发育水平的减低。(二)HCMV先天性感染影响子代大鼠海马DG区基础突触传递效能和颗粒细胞的共同发放，出现CAl区和DG区LTP/DP的诱发和维持障碍，导致突触可塑性降低。(三)HCMV先天性感染仔鼠损伤的海马组织中存在NMDA受体亚单位(GluNl，GluN2A和GluN2B)表达水平减低、GluN1/GluN2比例失衡以及CaMKⅡ表达水平的减低和钙离子浓度升高。(四)NMDA受体亚单位表达水平的下降、海马组织中CaMKⅡ的低表达和钙离子浓度的异常升高，从而影响突触可塑性的诱导和维持，可能是导致HCMV先天性感染损伤子代SD大鼠空间学习记忆功能的一个重要机制。