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急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是造血干细胞分化过程中成熟障碍、过度增殖及凋亡受阻的造血系统恶性疾病。随着临床化疗药物剂量的调整、新药的出现以及造血干细胞移植技术的发展，AML的完全缓解率(CR)和长期生存得到了明显提升,但仍有20%~40%的患者难以达到CR，且CR后60%左右的患者最终复发，年轻患者的5年生存率仅40%~45%，老年患者小于10%。不能获得CR以及缓解后复发的患者极有可能发展为难治性AML。对于难治/复发AML患者，目前尚无标准的挽救治疗方案，普通的化疗药物对其作用有限，探索新的挽救治疗方案意义重大。近年来分子靶向治疗的飞速发展，为难治/复发AML患者带来了福音。
Bcl-2作为一种抑凋亡蛋白，Bax是一种促凋亡蛋白，Bcl-2/Bax比例在调控细胞凋亡的过程中扮演着启动凋亡的“分子开关”的作用，Bcl-2和Bax形成异二聚体时则抑制细胞凋亡，而Bax之间形成同源二聚体时能诱导细胞凋亡。细胞在应激状态或者受到细胞毒物作用时，线粒体内膜和外膜之间的通透性转运孔开放，使线粒体的通透性增加。受损的线粒体将CytC释放到细胞质中，CytC与凋亡促进因子-1(Apaf-1)、caspase9形成凋亡复合体，导致caspase9的活化，酶解级联激活caspase3，使细胞凋亡。
Bcl-2高表达是白血病细胞凋亡受阻的重要因素，Venetoclax(ABT-199)作为一种口服、有效、靶向的Bcl-2抑制剂，已经在包括AML模型在内的各种肿瘤细胞的临床前体内/体外实验中显示了其有效性，但其单药对难治/复发AML疗效有限。Bim介导了ABT-199诱导AML细胞凋亡，Mcl-1和Bcl-xL则在ABT-199的耐药中扮演重要角色，Mcl-1和Bim结合促进了细胞存活，介导了AML细胞对ABT-199产生耐药。那么，能否通过联用ABT-199和其他化疗药物逆转AML细胞对ABT-199的耐药性，以达到更好的临床治疗效果呢？
三氧化二砷(arsenic trioxide，ATO)作为中国古老的促凋亡药物，体内外实验均证实其能够诱导细胞凋亡，从而抑制多发性骨髓瘤、前列腺癌、神经母细胞瘤等恶性肿瘤的生长。近年来，ATO在白血病治疗方面的研究进展较快。ABT-199和ATO均能下调Bcl-2的表达，从而诱导细胞凋亡。两者单药或与其它化疗药物联合治疗MDS、CLL等血液系统恶性肿瘤，显示出一定的疗效，并且二者与其它药物联合时疗效增强。ABT-199和ATO二者联合是否能产生更好的抗白血病效果，可作为难治/复发AML挽救治疗研究的切入点。
本研究主要从两个部分探讨Bcl-2抑制剂ABT-199联合三氧化二砷对急性髓系白血病细胞的协同促凋亡作用。第一，Bcl-2抑制剂ABT-199联合三氧化二砷在体内和体外实验中对急性髓系白血病细胞的协同促凋亡作用研究；第二，Bcl-2抑制剂ABT-199联合三氧化二砷协同促进ABT-199耐药的AML细胞凋亡的机制研究；此研究旨在探讨Bcl-2抑制剂ABT-199和三氧化二砷联合抗白血病的协同作用机制，为难治/复发AML提供新的更有效的治疗策略，为AML开展通用型靶向治疗提供潜在的研究方向。
第一部分Bcl-2抑制剂ABT-199联合三氧化二砷对急性髓系白血病细胞株和原代细胞的协同促凋亡作用研究
研究目的
以急性髓系白血病细胞株和急性髓系白血病原代细胞为研究对象，建立AML异种移植小鼠模型，研究Bcl-2抑制剂ABT-199联合三氧化二砷对急性髓系白血病细胞的协同促凋亡作用。
研究方法
1.Real-TimePCR和Westernblot检测AML细胞株(MOLM13、MV4;11、THP-1、oci-AML3、U937)中，Bcl-2、Mcl-1在mRNA和蛋白水平的表达情况。
2.CCK-8法检测ABT-199、ATO单药作用前后AML细胞株(MOLM13、MV4;11、THP-1、oci-AML3、U937)的增殖抑制水平，计算两药在24h和48h的IC50值。
3.流式细胞术检测不同浓度ABT-199、ATO单药及联合作用前后AML细胞株(MOLM13、MV4;11、THP-1、oci-AML3、U937)的线粒体膜电位、凋亡率。
4.流式细胞术检测不同浓度ABT-199、ATO单药及联合作用AML原代细胞及正常人单个核细胞前后的凋亡率。
5.建立AML异种移植小鼠模型，观察ABT-199、ATO单药及联合处理小鼠前后肿瘤的生长情况及各组小鼠生存期。
6.上述实验分别重复三次。统计学处理：数据用均数±标准差描述，两样本定量资料采用方差齐性检验及独立或配对样本t检验，定义P值小于0.05为具有统计学差异，采用SPSS18.0软件进行统计学分析。
研究结果
1.MOLM13、MV4;11、THP-1、oci-AML3、U937细胞株在mRNA和蛋白水平均表达Bcl-2、Mcl-1，其中，THP-1、oci-AML3、U937的Bcl-2表达水平较MOLM13、MV4;11低。
2.ABT-199、ATO单药均能抑制AML细胞株(MOLM13、MV4;11、THP-1、oci-AML3、U937)的增殖。THP-1、oci-AML3、U937细胞株在24h和48h的ABT-199IC50值较MV4;11、MOLM13的高，为对ABT-199耐药的细胞。AML细胞对ABT-199的IC50值与细胞系Bcl-2的蛋白表达水平呈负相关(P=0.041)。
3.ABT-199、ATO单药均能促进AML细胞株(MOLM13、MV4;11、THP-1、oci-AML3、U937)的凋亡，且呈浓度依赖性，两药联合后促凋亡作用进一步增强，两药有协同作用(CI<0.8)。
4.ABT-199、ATO单药均可降低MOLM13、MV4;11、THP-1、oci-AML3、U937细胞株线粒体膜电位，两药联合后此作用进一步增强(P<0.05)。
5.ABT-199、ATO协同促进AML原代细胞凋亡，对正常人单个核细胞无影响。
6.将MOLM13细胞尾静脉注射NOD/SCID小鼠，成功建立AML异种移植小鼠模型。ATO单药可抑制白血病，延长小鼠生存期(CON组VSATO组，10.5天VS14.5天，P=0.034)，联合ABT-199后作用进一步增强(CON组VS联合组，10.5天VS21.5天，P=0.011)。
第二部分Bcl-2抑制剂ABT-199联合三氧化二砷对急性髓系白血病细胞株协同促凋亡作用的机制研究
研究目的
研究Bcl-2抑制剂ABT-199联合三氧化二砷在急性髓系白血病细胞系中协同促凋亡作用的机制。
研究方法
1.Westernblot检测ABT-199、ATO单药及联合处理AML细胞株(MOLM13、MV4;11、THP-1、oci-AML3)8h、24h凋亡相关蛋白的表达水平。
2.ABT-199、ATO单药及两者联合作用THP-1、oci-AML3细胞4h、8h、12h、16h、20h、24h，流式细胞术检测细胞凋亡率。
3.对ABT-199、ATO及两者联合作用的THP-1、oci-AML3细胞进行转录组测序，分析差异表达基因，进行通路富集。
4.Real-TimePCR检测ABT-199、ATO单药及联合处理oci-AML3细胞株24h后的基因表达水平，Westernblot检测相关信号通路蛋白的表达水平。
5.流式细胞术检测ABT-199、ATO单药及联合作用前后oci-AML3细胞的细胞周期。
6.ABT-199、ATO单药及两者联合作用于oci-AML3细胞株8h，进行中性彗星实验，检测用药前后有无DNA损伤。
7.免疫共沉淀法检测ABT-199、ATO单药及联合处理oci-AML3细胞24h后凋亡相关蛋白Bim、Bcl-2、Mcl-1的相互作用。
8.瞬时转染敲低oci-AML3细胞的Bim，Westernblot检测转染前后细胞株Bim的表达水平，ABT-199、ATO单药及两者联合作用于转染前后的oci-AML3细胞株，流式细胞仪检测敲除前后各组凋亡情况。
9.上述实验分别重复三次。统计学处理：数据用均数±标准差描述，两样本定量资料采用方差齐性检验及独立或配对样本t检验，定义P值小于0.05为具有统计学差异，采用SPSS18.0软件进行统计学分析。
研究结果
1.ABT-199、ATO单药及联合处理AML细胞株(MOLM13、MV4;11、THP-1、oci-AML3)8h、24h后，联合组较单药组和对照组相比，γ-H2AX表达量升高，活化的cf-caspase3、cf-PARP的表达量升高；ABT-199、ATO单药及联合处理AML细胞株(MOLM13、MV4;11、THP-1、oci-AML3)24h后，ABT-199单药组较对照组Mcl-1蛋白表达量升高，联合ATO后Mcl-1表达量降低；联合组和对照组相比Bim、Bcl-xL蛋白表达量降低。
2.ABT-199、ATO作用于THP-1细胞、oci-AML3细胞4h、8h、12h、16h、20h、24h，两药协同促进AML细胞凋亡(P<或=0.001)，且具有时间依赖性。
3.对单药ABT-199、ATO及两者联合作用24h前后的THP-1、oci-AML3细胞进行转录组测序，ABT单药组和联合组差异表达基因功能富集主要集中于PI3K-AKT、P53相关通路。
4.Real-TimePCR结果提示ATO上调了P53基因的表达(P=0.001)，从而上调了其下游促凋亡相关基因Bax、PUMA、Apaf-1的表达，同时上调了周期相关基因P21的表达(P=0.000)；联合ABT-199作用于oci-AML3细胞后，P53、P21基因的表达量较ATO单药组下降，较阴性组升高(P=0.002、P=0.031)。
5.Westernblot结果提示单药ABT-199上调p-Mcl-1T表达、下调p-Mcl-1S表达，单药ATO能抑制p-AKT表达，活化GSK3β，下调p-Mcl-1T表达、上调p-Mcl-1S表达；单药ATO上调了P53、P21、p-ERK的表达。
6.ABT-199、ATO单药及联合处理oci-AML3细胞24h，ATO单药使细胞阻滞在G2期((32.7±1.2)%VS(8.1±0.4)%，P=0.002)，联合ABT-199后，阻滞在G2期的细胞减少((32.7±1.2)%VS(11.2±2.6)%，P=0.017)。
7.ABT-199、ATO单药及联合处理oci-AML3细胞8h，以尾部DNA百分比衡量，彗星实验提示ABT-199单药对DNA损伤无影响(P=0.117)，ATO可显著损伤DNA(P=0.013)，联合组比单药ATO造成的DNA损伤更大(P=0.003)。
8.ABT-199、ATO单药及联合处理oci-AML3细胞24h，免疫共沉淀结果提示联合ATO后，Bim和Mcl-1、Bcl-2的结合减少。
9.将NTC-shRNA和Bim-shRNA转染oci-AML3细胞，Westernblot证实Bim被敲低，ABT-199、ATO单药及联合作用于oci-AML3/shRNABim和oci-AML3/NTC24h，敲低Bim使ABT-199、ATO联合作用于细胞的促凋亡作用减弱(P=0.005)。
结论
1.MOLM13、MV4;11、THP-1、oci-AML3、U937细胞株在mRNA和蛋白水平均表达Bcl-2、Mcl-1，AML细胞系对ABT-199的敏感性与细胞系Bcl-2的蛋白表达水平呈正相关。
2.在ABT-199敏感和耐药AML细胞株以及AML原代细胞中，ABT-199和ATO协同促进AML细胞凋亡，具时间和浓度依赖性；体内实验两药联合可抑制AML异种移植小鼠肿瘤生长，延长小鼠生存期。
3.ATO可能是通过抑制AKT蛋白磷酸化，进而激活GSK3β，使Mcl-1由稳定的p-Mcl-1T状态转化为不稳定的p-Mcl-1S，从而降低Mcl-1蛋白的表达量，中和ABT-199单药引起的Mcl-1表达量升高，同时诱导DNA损伤、减少Bim和Mcl-1的结合，来逆转细胞对ABT-199的耐药的。
4.ATO使细胞阻滞在G2期，联合ABT-199后阻滞在G1期的细胞增多，这是两者协同抗AML的一个因素。
Bcl-2作为一种抑凋亡蛋白，Bax是一种促凋亡蛋白，Bcl-2/Bax比例在调控细胞凋亡的过程中扮演着启动凋亡的“分子开关”的作用，Bcl-2和Bax形成异二聚体时则抑制细胞凋亡，而Bax之间形成同源二聚体时能诱导细胞凋亡。细胞在应激状态或者受到细胞毒物作用时，线粒体内膜和外膜之间的通透性转运孔开放，使线粒体的通透性增加。受损的线粒体将CytC释放到细胞质中，CytC与凋亡促进因子-1(Apaf-1)、caspase9形成凋亡复合体，导致caspase9的活化，酶解级联激活caspase3，使细胞凋亡。
Bcl-2高表达是白血病细胞凋亡受阻的重要因素，Venetoclax(ABT-199)作为一种口服、有效、靶向的Bcl-2抑制剂，已经在包括AML模型在内的各种肿瘤细胞的临床前体内/体外实验中显示了其有效性，但其单药对难治/复发AML疗效有限。Bim介导了ABT-199诱导AML细胞凋亡，Mcl-1和Bcl-xL则在ABT-199的耐药中扮演重要角色，Mcl-1和Bim结合促进了细胞存活，介导了AML细胞对ABT-199产生耐药。那么，能否通过联用ABT-199和其他化疗药物逆转AML细胞对ABT-199的耐药性，以达到更好的临床治疗效果呢？
三氧化二砷(arsenic trioxide，ATO)作为中国古老的促凋亡药物，体内外实验均证实其能够诱导细胞凋亡，从而抑制多发性骨髓瘤、前列腺癌、神经母细胞瘤等恶性肿瘤的生长。近年来，ATO在白血病治疗方面的研究进展较快。ABT-199和ATO均能下调Bcl-2的表达，从而诱导细胞凋亡。两者单药或与其它化疗药物联合治疗MDS、CLL等血液系统恶性肿瘤，显示出一定的疗效，并且二者与其它药物联合时疗效增强。ABT-199和ATO二者联合是否能产生更好的抗白血病效果，可作为难治/复发AML挽救治疗研究的切入点。
本研究主要从两个部分探讨Bcl-2抑制剂ABT-199联合三氧化二砷对急性髓系白血病细胞的协同促凋亡作用。第一，Bcl-2抑制剂ABT-199联合三氧化二砷在体内和体外实验中对急性髓系白血病细胞的协同促凋亡作用研究；第二，Bcl-2抑制剂ABT-199联合三氧化二砷协同促进ABT-199耐药的AML细胞凋亡的机制研究；此研究旨在探讨Bcl-2抑制剂ABT-199和三氧化二砷联合抗白血病的协同作用机制，为难治/复发AML提供新的更有效的治疗策略，为AML开展通用型靶向治疗提供潜在的研究方向。
第一部分Bcl-2抑制剂ABT-199联合三氧化二砷对急性髓系白血病细胞株和原代细胞的协同促凋亡作用研究
研究目的
以急性髓系白血病细胞株和急性髓系白血病原代细胞为研究对象，建立AML异种移植小鼠模型，研究Bcl-2抑制剂ABT-199联合三氧化二砷对急性髓系白血病细胞的协同促凋亡作用。
研究方法
1.Real-TimePCR和Westernblot检测AML细胞株(MOLM13、MV4;11、THP-1、oci-AML3、U937)中，Bcl-2、Mcl-1在mRNA和蛋白水平的表达情况。
2.CCK-8法检测ABT-199、ATO单药作用前后AML细胞株(MOLM13、MV4;11、THP-1、oci-AML3、U937)的增殖抑制水平，计算两药在24h和48h的IC50值。
3.流式细胞术检测不同浓度ABT-199、ATO单药及联合作用前后AML细胞株(MOLM13、MV4;11、THP-1、oci-AML3、U937)的线粒体膜电位、凋亡率。
4.流式细胞术检测不同浓度ABT-199、ATO单药及联合作用AML原代细胞及正常人单个核细胞前后的凋亡率。
5.建立AML异种移植小鼠模型，观察ABT-199、ATO单药及联合处理小鼠前后肿瘤的生长情况及各组小鼠生存期。
6.上述实验分别重复三次。统计学处理：数据用均数±标准差描述，两样本定量资料采用方差齐性检验及独立或配对样本t检验，定义P值小于0.05为具有统计学差异，采用SPSS18.0软件进行统计学分析。
研究结果
1.MOLM13、MV4;11、THP-1、oci-AML3、U937细胞株在mRNA和蛋白水平均表达Bcl-2、Mcl-1，其中，THP-1、oci-AML3、U937的Bcl-2表达水平较MOLM13、MV4;11低。
2.ABT-199、ATO单药均能抑制AML细胞株(MOLM13、MV4;11、THP-1、oci-AML3、U937)的增殖。THP-1、oci-AML3、U937细胞株在24h和48h的ABT-199IC50值较MV4;11、MOLM13的高，为对ABT-199耐药的细胞。AML细胞对ABT-199的IC50值与细胞系Bcl-2的蛋白表达水平呈负相关(P=0.041)。
3.ABT-199、ATO单药均能促进AML细胞株(MOLM13、MV4;11、THP-1、oci-AML3、U937)的凋亡，且呈浓度依赖性，两药联合后促凋亡作用进一步增强，两药有协同作用(CI<0.8)。
4.ABT-199、ATO单药均可降低MOLM13、MV4;11、THP-1、oci-AML3、U937细胞株线粒体膜电位，两药联合后此作用进一步增强(P<0.05)。
5.ABT-199、ATO协同促进AML原代细胞凋亡，对正常人单个核细胞无影响。
6.将MOLM13细胞尾静脉注射NOD/SCID小鼠，成功建立AML异种移植小鼠模型。ATO单药可抑制白血病，延长小鼠生存期(CON组VSATO组，10.5天VS14.5天，P=0.034)，联合ABT-199后作用进一步增强(CON组VS联合组，10.5天VS21.5天，P=0.011)。
第二部分Bcl-2抑制剂ABT-199联合三氧化二砷对急性髓系白血病细胞株协同促凋亡作用的机制研究
研究目的
研究Bcl-2抑制剂ABT-199联合三氧化二砷在急性髓系白血病细胞系中协同促凋亡作用的机制。
研究方法
1.Westernblot检测ABT-199、ATO单药及联合处理AML细胞株(MOLM13、MV4;11、THP-1、oci-AML3)8h、24h凋亡相关蛋白的表达水平。
2.ABT-199、ATO单药及两者联合作用THP-1、oci-AML3细胞4h、8h、12h、16h、20h、24h，流式细胞术检测细胞凋亡率。
3.对ABT-199、ATO及两者联合作用的THP-1、oci-AML3细胞进行转录组测序，分析差异表达基因，进行通路富集。
4.Real-TimePCR检测ABT-199、ATO单药及联合处理oci-AML3细胞株24h后的基因表达水平，Westernblot检测相关信号通路蛋白的表达水平。
5.流式细胞术检测ABT-199、ATO单药及联合作用前后oci-AML3细胞的细胞周期。
6.ABT-199、ATO单药及两者联合作用于oci-AML3细胞株8h，进行中性彗星实验，检测用药前后有无DNA损伤。
7.免疫共沉淀法检测ABT-199、ATO单药及联合处理oci-AML3细胞24h后凋亡相关蛋白Bim、Bcl-2、Mcl-1的相互作用。
8.瞬时转染敲低oci-AML3细胞的Bim，Westernblot检测转染前后细胞株Bim的表达水平，ABT-199、ATO单药及两者联合作用于转染前后的oci-AML3细胞株，流式细胞仪检测敲除前后各组凋亡情况。
9.上述实验分别重复三次。统计学处理：数据用均数±标准差描述，两样本定量资料采用方差齐性检验及独立或配对样本t检验，定义P值小于0.05为具有统计学差异，采用SPSS18.0软件进行统计学分析。
研究结果
1.ABT-199、ATO单药及联合处理AML细胞株(MOLM13、MV4;11、THP-1、oci-AML3)8h、24h后，联合组较单药组和对照组相比，γ-H2AX表达量升高，活化的cf-caspase3、cf-PARP的表达量升高；ABT-199、ATO单药及联合处理AML细胞株(MOLM13、MV4;11、THP-1、oci-AML3)24h后，ABT-199单药组较对照组Mcl-1蛋白表达量升高，联合ATO后Mcl-1表达量降低；联合组和对照组相比Bim、Bcl-xL蛋白表达量降低。
2.ABT-199、ATO作用于THP-1细胞、oci-AML3细胞4h、8h、12h、16h、20h、24h，两药协同促进AML细胞凋亡(P<或=0.001)，且具有时间依赖性。
3.对单药ABT-199、ATO及两者联合作用24h前后的THP-1、oci-AML3细胞进行转录组测序，ABT单药组和联合组差异表达基因功能富集主要集中于PI3K-AKT、P53相关通路。
4.Real-TimePCR结果提示ATO上调了P53基因的表达(P=0.001)，从而上调了其下游促凋亡相关基因Bax、PUMA、Apaf-1的表达，同时上调了周期相关基因P21的表达(P=0.000)；联合ABT-199作用于oci-AML3细胞后，P53、P21基因的表达量较ATO单药组下降，较阴性组升高(P=0.002、P=0.031)。
5.Westernblot结果提示单药ABT-199上调p-Mcl-1T表达、下调p-Mcl-1S表达，单药ATO能抑制p-AKT表达，活化GSK3β，下调p-Mcl-1T表达、上调p-Mcl-1S表达；单药ATO上调了P53、P21、p-ERK的表达。
6.ABT-199、ATO单药及联合处理oci-AML3细胞24h，ATO单药使细胞阻滞在G2期((32.7±1.2)%VS(8.1±0.4)%，P=0.002)，联合ABT-199后，阻滞在G2期的细胞减少((32.7±1.2)%VS(11.2±2.6)%，P=0.017)。
7.ABT-199、ATO单药及联合处理oci-AML3细胞8h，以尾部DNA百分比衡量，彗星实验提示ABT-199单药对DNA损伤无影响(P=0.117)，ATO可显著损伤DNA(P=0.013)，联合组比单药ATO造成的DNA损伤更大(P=0.003)。
8.ABT-199、ATO单药及联合处理oci-AML3细胞24h，免疫共沉淀结果提示联合ATO后，Bim和Mcl-1、Bcl-2的结合减少。
9.将NTC-shRNA和Bim-shRNA转染oci-AML3细胞，Westernblot证实Bim被敲低，ABT-199、ATO单药及联合作用于oci-AML3/shRNABim和oci-AML3/NTC24h，敲低Bim使ABT-199、ATO联合作用于细胞的促凋亡作用减弱(P=0.005)。
结论
1.MOLM13、MV4;11、THP-1、oci-AML3、U937细胞株在mRNA和蛋白水平均表达Bcl-2、Mcl-1，AML细胞系对ABT-199的敏感性与细胞系Bcl-2的蛋白表达水平呈正相关。
2.在ABT-199敏感和耐药AML细胞株以及AML原代细胞中，ABT-199和ATO协同促进AML细胞凋亡，具时间和浓度依赖性；体内实验两药联合可抑制AML异种移植小鼠肿瘤生长，延长小鼠生存期。
3.ATO可能是通过抑制AKT蛋白磷酸化，进而激活GSK3β，使Mcl-1由稳定的p-Mcl-1T状态转化为不稳定的p-Mcl-1S，从而降低Mcl-1蛋白的表达量，中和ABT-199单药引起的Mcl-1表达量升高，同时诱导DNA损伤、减少Bim和Mcl-1的结合，来逆转细胞对ABT-199的耐药的。
4.ATO使细胞阻滞在G2期，联合ABT-199后阻滞在G1期的细胞增多，这是两者协同抗AML的一个因素。