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背景和目的由于生命科学的快速发展,体外诊断方式不断与时俱进,用于现场检验的即时检测技术（POCT）由于临床需求而应运而生,即时检测技术是一种能够实现小型、快速、经济、即时、简易的检验方式。即时检测（POCT）,简单得来说是指一种快速检测分析技术,它作为临床实验室学科的一个方向在近十年得到了迅猛的发展。由于生物样品存在靶标浓度低,成分较复杂等特点,在现场检验无法采用大型仪器时,怎样创建灵敏度高、特异性强、操作简单、便携式的检测方法仍然是即时检测领域当今需要积极解决的主要科学问题。Yang课题组近年来研发的基于气压传感的生物检测平台[pressure-based ELISA（P-B-E for short）从体外诊断技术的现状与需求出发,围绕体外诊断发展的两个重要方向—即时检测和精准诊断,不断的改进。Yang课题组研发的基于气压传感的生物传感平台是利用铂纳米颗粒（PtNPs）具有过氧化氢酶活性并且可催化分解H2O2产生氧气这一原理,将修饰了生物素的PtNPs引入免疫反应中,然后在链霉亲和素/生物素的作用下同免疫反应中形成的“三明治”结构结合,通过催化底物过氧化氢产气,产生气压压强信号,最终通过手持气压计测定,成功将免疫信号转化为气压信号。气压平台建立以来,先后进行了CRP、PSA、HER-2蛋白等靶标的测定,检测结果与ELISA金标准相比具有较好的一致性,检测灵敏度与普通ELISA大致相同。并且通过实验可知非专业人员通过气压平台检测蛋白靶标的结果与专业人员相比误差并不大。由此可见,气压平台满足了即时检测要求的小型、简易、快速、即时等特点。由于临床上提倡疾病早期发现、早期诊断、早期治疗,现在我们希望能够提高气压平台的检测灵敏度,增强即时检测设备的精准性和疾病早筛功能。信号放大的装置有很多,比如碳纳米笼、介孔氧化硅、经过筛选,本研究将聚丙烯酸球刷作为信号放大的酶载体,结合气压平台,研发一种基于聚丙烯酸球刷放大体系的气压检测新方法,完成对H5NI蛋白的定量检测,并与传统ELISA结果进行对比。其次,既往的气压平台所用到的的铂颗粒合成后在一定时间内即会发生团聚、活性降低等,所以每次检测时用到的铂颗粒都需要现配现用。这很大的限制了气压平台作为真正的即时检测装置进行产品转化的脚步。本论文要解决的另一个问题是合成一种稳定的易于保存的新型铂颗粒。本研究旨在构建一种便携的、低成本的、操作简单的、高灵敏度的气压检测新方法。研究内容与方法聚丙烯酸球刷是酶载体,具有放大信号的作用。铂纳米颗粒（PtNPs）具有类过氧化氢酶活性,可催化分解H2O2为氧气。本研究中将重新设计新型的具有稳定的催化活性的PtNPs。将聚丙烯酸球刷分别包裹具有过氧化氢酶活性的新型PtNPs和传统的过氧化氢酶（Catalase）后实现酶放大效应,聚丙烯球刷内层包裹催化剂后最外层可再与检测抗体偶联然后引入免疫反应中。再与免疫反应中形成的抗原-捕获抗体结构结合,催化底物过氧化氢产气,产生气压压强,最终通过手持小型气压计测定。并使用构建的新型检测方法对H5NI蛋白进行检测,并与传统方法进行比较。主要研究方法为酶联免疫吸附法（ELISA）及引入基于聚丙烯酸球刷放大体系结合气压平台的双抗夹心ELISA实验。研究结果成功地合成了新型PtNPs,成功的将新型PtNPs和Catalase包裹到聚丙烯酸球刷中,构建了基于聚丙烯酸球刷信号放大体系的气压检测新方法,并且构建了基于气压平台结合游离的PtNPs和游离的catalase检测体系。在实验过程中,对新型铂纳米颗粒和catalase的催化活性进行了监测,对聚丙烯酸球刷包裹新型铂纳米颗粒和catalase的方法进行了优化。实验结果可知:基于聚丙烯酸球刷包裹铂纳米颗粒信号放大体系的气压检测法测H5N1蛋白在200uL反应体系、反应时长1h、30%H2O2底物浓度的反应条件下,检测灵敏度为0.2ng/mL,基于气压平台与游离的PtNPs检测体系对于H5N1蛋白的检测限为14ng/ml。所以从目前数据来说,聚丙烯酸球刷是具有放大信号的作用的,将信号放大了70倍。与传统ELISA法相比,未能实现大幅提高灵敏度的目标,后期将继续优化实验条件,提高灵敏度。基于聚丙烯酸球刷包裹catalase放大体系的气压检测法测H5N1蛋白在200uL反应体系、反应时长1 h、1%H2O2底物浓度的反应条件下,检测灵敏度0.01ng/mL,基于气压平台与游离的catalase检测体系对H5N1蛋白的检测限为10ng/ml。所以基于聚丙烯酸球刷包裹catalase放大体系的气压检测法与游离的Catalase体系相比将检测信号放大了100倍。传统ELISA法相比成功将信号放大了20倍。结论1.成功合成新型铂纳米颗粒（PtNPs）,将PtNPs包裹到聚丙烯酸球刷中然后引入免疫反应体系中,建立基于聚丙烯酸球刷信号放大体系的气压检测新方法,检测灵敏度为0.2ng/mL。目前与普通ELISA相比的话灵敏度相当。2.成功将catalase包裹到聚丙烯酸球刷中然后引入免疫反应体系中,建立基于聚丙烯酸球刷信号放大体系的气压检测新方法（Pressure-based ELISA,short for P-B-E）,检测灵敏度为0.01ng/mL,与普通ELISA的灵敏度相比实验了信号放大的目标。