背景和目的脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）是临床上常见的一种脊柱外科疾病,它会引起脊髓神经元缺失、轴突断裂等一系列病理改变,对于任何一个脊髓损伤患者而言,这都是一个灾难,因为它会导致患者损伤平面以下的感觉、运动和自主神经功能障碍,甚至会引起呼吸、泌尿、消化系统等多个器官的功能异常,而且很难完全恢复原有的功能。目前临床上常用的治疗方法有药物治疗、手术治疗和康复治疗等,但是这些方法均不能实现对脊髓的结构性重建,促进神经元再生并恢复轴突传导功能。组织工程技术通过将支架、种子细胞和细胞因子进行有效地结合,为脊髓损伤恢复带来了新的可能性。此前的研究认为,与普通的间充质干细胞相比,神经分化的间充质干细胞可以更好地促进脊髓功能恢复,而持续性释放细胞因子的支架要比普通支架具有更好的修复效果。为此本研究首先设计了一种新型支架,它能够直接贴敷在损伤脊髓的表面,既可以持续释放神经生长因子,又可以粘附预神经分化的骨髓间充质干细胞,然后将其移植入急性脊髓损伤的大鼠体内,评估这种联合治疗方案移植修复大鼠急性脊髓损伤的效果。方法1.体外实验采用全骨髓贴壁法获取SD大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）,对获取的细胞采用流式细胞分析仪进行鉴定,采用多个细胞因子联合诱导的方法在体外将BMSCs诱导为神经元样细胞,并通过免疫荧光染色对诱导细胞的神经细胞标记物进行检测,以此证实神经诱导方案的可行性。在不含有神经生长因子（NGF）的空白支架与可持续释放NGF的实验支架上种植成神经分化诱导6天的BMSCs,于12h、24h、48h三个时间点用CCK-8法检测这两种支架上细胞的存活率。然后将成神经分化诱导6天的BMSCs转移到空白支架与实验支架上,继续诱导12天,扫描电镜观察诱导细胞的形态变化,免疫荧光染色检测这两种支架上细胞的神经细胞标记物,以此来观察预神经分化BMSCs与新型薄膜支架之间的生物相容性。利用蛋白印迹分析方法来检测TrkA/ERK通路中的关键蛋白,初步探查不含有NGF的空白支架与可持续释放NGF的实验支架在诱导BMSCs分化为神经细胞过程中存在差异性的可能机制。2.体内实验用ALLEN’S打击法制备大鼠急性脊髓损伤模型,然后通过组织工程技术治疗急性脊髓损伤的大鼠,移植细胞采用普通BMSCs和预神经分化BMSCs,支架采用可持续释放NGF的实验支架和不含有NGF的空白支架,根据实验需要进行分组干预。术后通过BBB运动评分和斜板实验连续8周持续观察SCI大鼠的运动功能恢复情况,术后第1,4,8周通过H＆E染色/尼氏染色、免疫荧光染色以及神经电生理检测来观察各组大鼠脊髓损伤组织中的神经元和轴突再生、轴突再髓鞘化、空洞与胶质瘢痕形成以及轴突的神经传导情况。结果1.体外实验采用全骨髓贴壁法分离的贴壁细胞呈相对分布均匀的纺锤形。利用流式细胞分析仪对这些贴壁细胞进行表征,结果显示其CD45、CD34阴性,CD90、CD44阳性,证实这些贴壁细胞是纯度很高的骨髓间充质干细胞。采用多个细胞因子联合方案诱导后BMSCs出现类神经细胞样结构,细胞胞体皱缩并形成细长突触,进一步的免疫荧光染色检测,发现细胞中神经干细胞标记物nestin阳性细胞约为50%,而神经元标记物MAP2阳性率约为70%。CCK-8检测发现,与无支架条件下成神经分化诱导的BMSCs相比,空白支架与实验支架上这些预神经分化BMSCs的存活率并没有明显变化。将成神经分化诱导6天的BMSCs转移到两种支架上,继续诱导12天后,扫描电镜下观察发现部分细胞呈现神经细胞形态改变,其胞体缩小,突触细长。而免疫荧光染色检测发现所有细胞f-actin均为阳性,实验支架上细胞的nestin阳性率约为60%,MAP2阳性率约70%,GFAP阳性率约10%,空白支架上细胞的nestin阳性率约为50%,MAP2阳性率约50%,GFAP阳性率约20-25%,二者之间差异存在统计学意义。这些结果说明预神经分化BMSCs与新型薄膜支架之间存在着良好的生物相容性。在诱导方案相同的情况下,实验支架组成神经分化的细胞比例明显高于空白支架组。采用蛋白印迹分析的方法初步检测了TrkA/ERK通路中关键蛋白一磷酸化的TrkA和ERK。结果显示二者在实验支架组细胞中的含量明显多于空白支架组,差异有统计学意义。2.体内实验术后第1、4、8周观察移植物在伤口内的变化,结果发现所有移植物均位置良好。根据BBB运动评分和斜板实验发现,采用种植了预神经分化BMSCs的可持续释放NGF支架组（联合组）大鼠的运动功能和前后肢体的协调性明显好于其他各手术组,H＆E染色和尼氏染色结果显示联合组大鼠脊髓组织结构相对完整,尼氏体数量较多,空洞较少,而其他各手术组脊髓结构混乱,神经细胞广泛崩解,尼氏体数量减少且存在较多大的空洞。GFAP作为星形胶质细胞标记物,间接反映胶质瘢痕形成情况,在联合组大鼠脊髓组织中阳性率最低,且明显低于其他各手术组。神经元标记物MAP2和NeuN可以反映损伤部位神经元的数量,二者在联合组大鼠脊髓组织中阳性率最高,且明显高于其他各手术组。高尔基染色可以检测树突棘的密度,间接反映神经元之间的连接性,结果显示联合组大鼠脊髓组织中树突棘密度最高,且明显高于其他各手术组。MBP可以反映轴突的再髓鞘化,结果显示联合组大鼠脊髓组织中MBP阳性率最高,且明显高于其他各手术组。诱发电位的峰值和宽度可以反映脊髓损伤后再生轴突的数量和神经的传导速度,联合组大鼠SEP与MEP振幅显著高于其他各手术组,而潜伏期则显著短于其他各手术组。在以上各种观察指标中,联合组与其他各手术组之间的差异均存在统计学意义。结论1.通过全骨髓贴壁法可以获得纯度很高的BMSCs,在体外采用多个细胞因子联合的诱导方法可以成功地将BMSCs诱导为神经元细胞。2.预神经分化BMSCs与新型薄膜支架之间具有良好的生物相容性。3.在NGF和壳聚糖共同存在的条件下,BMSCs可以被诱导为神经元细胞,在这一过程中,NGF起着重要的作用,初步推测其机制可能是通过TrkA/ERK通路来实现的。4.与单独移植预神经分化BMSCs或可持续释放NGF支架的治疗方案相比,预神经分化BMSCs联合持续释放NGF支架的治疗方案可以更好地促进SCI大鼠脊髓的神经功能恢复。