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目的
支气管哮喘(哮喘)是儿童时期常见的慢性气道炎症性疾病,气道可逆性气流受限、气道高反应及气道重塑是其级联反应,因此控制气道炎症是哮喘控制的关键因素。糖皮质激素是哮喘治疗的一线用药,但目前发现糖皮质激素耐受或不敏感已经成为哮喘治疗中的一个严重障碍。1,25-二羟维生素D3[1,25(OH)2D3]是维生素D3生物活性代谢产物,它不仅是体内骨代谢及钙稳态的关键性调控因子,同时还是一种第二类固醇激素,具有重要的免疫调节作用。研究发现血清维生素D的水平降低与糖皮质激素治疗的反应性下降有关;维生素D能够促进地塞米松发挥作用,提示维生素D作为一种免疫调节剂对哮喘可能具有辅助治疗作用,尤其对激素耐受性或难治性哮喘,但其作用机制尚不十分清楚。调节正常T细胞表达和分泌的趋化因子RANTES(regulated on activation,normal T cells expressed and secreted,RANTES),在免疫应答和炎症反应中能够吸附单核细胞,嗜酸性粒细胞及T细胞迁移至炎症部位,是哮喘气道炎症反应的重要炎症介质。本实验从组织、细胞和分子水平研究维生素D对哮喘大鼠RANTES表达的影响,旨在探讨维生素D参与控制哮喘气道炎症及与激素协同作用的作用机制,为哮喘、尤其是难治性哮喘的临床治疗提供新的治疗途径奠定理论和实验基础。
方法
40只SPF级雌性Wistar大鼠随机分为正常对照组、哮喘组、维生素D干预组、普米克干预组和联合干预组。0.1%卵白蛋白(ovalbumin,OVA)腹腔注射对实验组进行致敏(第1天和第8天),1%OVA雾化激发(第15天-21天)建立急性哮喘模型,并于激发阶段对各实验组大鼠进行干预(腹腔注射维生素D或雾化吸入普米克混悬液);正常对照组用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)代替OVA进行致敏和激发:末次激发后24小时内取材,对各组大鼠进行气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells,ASMCs)原代培养;肺组织石蜡包埋切片后行HE染色观察病理变化;ELISA法检测各组支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中趋化因子RANTES的含量;免疫组化方法测定各组肺组织RANTES蛋白的表达情况;实时定量PCR测定各组肺组织及ASMCs中RANTES mRNA的表达。另取哮喘组大鼠进行ASMCs的原代培养,培养至4-6代时,将长至80%融合的细胞用含0.1%小牛血清的培养基进行同步化处理24小时;然后分为两组进行1,25(OH)2D3的干预,一组在相同的时间点加入不同浓度的1,25(OH)2D3,浓度分别为(0.001nM、0.01nM、0.1nM、1nM、10nM、100nM),另一组细胞在不同时间点(相对肿瘤坏死因子进行刺激时间分别为-1h,0h,6h,12h,0r18h)加入相同浓度的1,25(OH)2D3;ELISA法检测培养基上清中ASMCs分泌的RANTES的含量。
结果
1.病理改变:哮喘组大鼠气道炎症反应最明显,出现炎症细胞侵润、气道狭窄变形及平滑肌的断裂,各个干预组有不同程度的缓解。2.肺组织RANTES蛋白的表达:哮喘组大鼠肺组织中RANTES蛋白的表达最强,光密度值为:0.4352±0.087;维生素D组为:0.300±0.048;普米克组为:0.248±0.0214;普米克联合维生素D治疗组的表达进一步下降为:0.1654±0.0219,各干预组与哮喘组相比差异有统计学意义(P＜0.05);联合组与普米克组相比,差异有统计学意义(P＜0.05)。3.RANTESmRNA的表达:肺组织中:哮喘组相对扩增倍数为3.3695±0.592,维生素D组为2.1311±0.919,与哮喘组相比无意义(P=0.377);普米克组为1.7488±0.399,与哮喘组相比无意义(P=0.059);联合治疗组为1.4804±0.304,与哮喘组相比有意义(P=0.021)。ASMCs中:正常组RANTES相对扩增倍数为:1.526±0.3778,哮喘组为:4.289±0.881,与正常组相比差异有统计学意义(P＜0.05);维生素D组为3.222±0.499,普米克组为2.013±0.546,联合治疗组为1.531±0.735,各干预组与哮喘组相比差异有统计学意义(P＜0.05)。4.细胞水平上的干预显示,在一定浓度范围内,随着1,25(OH)2D3的浓度增加,ASMCs分泌的RANTES的含量逐渐减少。
结论
RANTES在哮喘大鼠肺泡灌洗液、肺组织中的蛋白及mRNA的表达水平明显增高,在ASMCs中的表达也明显升高;维生素D的干预可以使哮喘大鼠肺泡灌洗液、肺组织中的蛋白及mRNA的表达水平降低,提示通过调节RANTES的表达来减轻气道炎症反应;维生素D与普米克联合干预可以使其表达进一步下降,优于单独使用普米克干预;维生素D对气道平滑肌细胞分泌RANTES的调节作用具有浓度依赖和时间依赖特点。