呼吸机诱导性肺损伤(VILI)是临床常见的有创通气并发症,也是引起急性呼吸窘迫综合征(ARDS)患者发生肺纤维化的重要因素。目前认为,机械牵拉引致的多种肺内细胞的功能活化及相关信号通路的激活与VILI后肺纤维化的发生密切相关。已知在多种肺部损伤性疾病中,巨噬细胞亚群,尤其是M2型巨噬细胞对修复至关重要,但关于其在VILI后组织修复中的转归及调控机制尚属空白。另一方面,以小潮气量和较高水平呼气末正压(PEEP)为代表的肺保护性通气策略已经被证实可显著降低VILI的发生率,改善预后,但仍然无法完全避免VILI后肺纤维化的发生。中医药(TCM)是我国医学的特有组成成分,基于中药有效单体成分的药物研究也是目前新药开发的热点之一。低分子量褐藻多糖硫酸酯(LMWF)是从海带中提取得到的高度硫酸化杂多糖,具有炎症、免疫调节,抑制纤维增生等多种生物活性,但尚未有LMWF与肺纤维化相关疾病的研究。基于上述背景,本课题分以下四部分进行研究,以期为VILI后组织修复的分子机制及干预研究提供新的思路和靶标。一、小鼠呼吸机诱导性肺损伤后肺纤维化模型的建立及评价目的:建立小鼠VILI后肺纤维化模型,为其机制研究提供稳定的模型基础。方法:1.实验分组:将C57BL/6小鼠随机分为假手术组(n=21)和大潮气量通气组(n=90),分别于撤机后第Oh、1d、3d、5d、7d、14d取材;2.HE染色、Masson染色、天狼星红染色观察肺部基本病理改变及病变过程中胶原沉积部位和类型的变化;3.免疫组化法检测肺组织α-SMA表达;4.二喹啉甲酸(BCA)法检测支气管肺泡灌洗液(BALF)总蛋白浓度;5.湿干比判断肺水情况;6.碱水解法测定肺组织羟脯氨酸含量;7.酶联免疫吸附法(ELISA)检测BALF、血浆中转化生长因子-β1(TGF-β1)水平;8.实时定量 PCR检测肺组织TGF-β1、结缔组织生长因子(CTGF)、Collagen I mRNA表达水平。结果:1.撤机后1天内,小鼠BALF总蛋白浓度及湿干比显著升高,提示早期肺泡渗出和组织水肿;2.撤机后第3天,小鼠肺组织中TGF-β1和CTGF mRNA表达上调,第5天Collagen ImRNA表达上调;3.第7天,小鼠肺部可见间质细胞增生及胶原沉积,I型胶原和α-SMA表达显著增加。肺组织羟脯氨酸含量以及BALF、血浆中TGF-β1水平均升高。结论:20mL/kg大潮气量及0 cmH20 PEEP持续机械通气4小时构建VILI模型,撤机后7天可建立理想的小鼠VILI后肺纤维化模型。二、呼吸机诱导性肺损伤后肺纤维化动物模型的转录组学研究目的:通过转录组测序,揭示VILI后肺纤维化病程中潜在的分子机制,为机制研究提供可靠的依据。方法:1.利用高通量测序技术检测假手术组、VILI Od和VILI 7d小鼠(n=3)肺组织中的所有转录本和长链非编码RNA(IncRNAs),分析组间的差异表达基因;2.GO和KEGG分析探讨疾病过程中重要的生物学过程及功能通路;3.通过共定位和共表达的方式对差异表达IncRNAs进行靶基因预测,再采用GO和KEGG分析探讨这些差异IncRNAs在VILI后组织修复中的潜在调控作用。结果:1.撤机早期,以损伤相关分子模式(DAMPs)为代表的无菌性炎症反应被显著激活,大量趋化因子活化;撤机后一周,纤维增生、细胞外基质(ECM)合成、沉积、降解等相关基因表达显著上调,并且巨噬细胞、肺泡上皮细胞功能和分化相关的基因表达也显著上调;2.刺激反应、免疫调节是VILI后重要的生物学过程,其中mTOR、JAK/STAT、cAMP信号通路有可能是调控VILI早期炎症的潜在分子机制,而TGF-β、HIF-1、TLR、NF-κB等信号通路则可能主要参与了肺纤维化;3.差异表达IncRNAs有可能通过Wnt、HIF-1、TLR等信号通路参与调控VILI后组织修复。结论:1.VILI后第7天转录组测序结果揭示了组织损伤和修复过程中,巨噬细胞分化相关基因表达增加,并且伴有上皮细胞增殖、迁移、分化等通路转录活性增强;2.TGF-β、HIF-1、TLR、Wnt等信号通路激活可能参与了分化与功能调控,是引起VILI后肺纤维化的潜在机制。三、巨噬细胞分化在呼吸机诱导性肺损伤后组织修复中的变化规律及作用机制目的:研究巨噬细胞亚群在VILI后组织修复中的分化情况,以及参与调节肺组织修复的潜在机制,为VILI后肺纤维化的防治提供新观点。方法:1.实验分组:将C57BL/6小鼠随机分为假手术组(n=10)和大潮气量通气组(n=90),分别于撤机后Od,1d,3d,5d,7d,14d取材;2.在体实验:免疫荧光、流式细胞术检测肺内M1和M2型巨噬细胞亚群比例及数量变化;免疫组化、免疫荧光和WB检测肺组织钙粘附蛋白E(E-cadherin)、vimentin、α-SMA、纤粘蛋白(fibronectin)及 TGF-β1、p-Smad2/3、t-Smad2/3 表达水平;3.离体实验:提取小鼠骨髓来源单核细胞,诱导分化成为M0、M1、M2型巨噬细胞后分别与MLE-12共培养,48小时后观察细胞形态、增殖、迁移、凋亡及EMT表型;免疫荧光、WB检测上皮细胞TGF-β1、p-Smad2/3、t-Smad2/3蛋白表达。结果:1.撤机后第1天,小鼠肺组织及BALF中M1型巨噬细胞数量显著增加,至第5天M1/M2比例逆转,M2型巨噬细胞显著增加,并维持在较高的表达至撤机后2周;2.撤机后第7天,小鼠肺组织E-cadherin的表达较假手术组显著降低,vimentin、α-SMA、fibronectin 以及 TGF-β1、p-Smad2/3 的表达则有所增加;3.体外实验发现,原代M2型巨噬细胞能促进MLE-12向纺锤体形状改变,并且促进其增殖、迁移及抑制凋亡。在蛋白表达上,M2能抑制上皮E-cadherin表达,促进vimentin、α-SMA,fibronectin、TGF-β1、p-Smad2/3 的表达。结论:1.在健康小鼠肺上实施大潮气量正压机械通气可引起肺部巨噬细胞亚群数量和比例的变化,表现为VILI早期,以M1型巨噬细胞表达为主,而第5天开始,两者比例逆转,M2型巨噬细胞显著增加,并维持在较高的表达至撤机后2周;2.M2型巨噬细胞激活的上皮TGF-β1/Smad信号通路,参与调节了上皮增殖、迁移、凋亡及EMT等过程,可能是引起VILI后肺纤维化的潜在机制。四、低分子量褐藻多糖硫酸酯在呼吸机诱导性肺损伤后组织修复中的作用及机制研究目的:初步观察LMWF在VILI后组织修复中的作用及可能机制,为中医药单体防治肺纤维化相关疾病开阔思路。方法:1.实验分组:60只小鼠随机分为假手术组、模型组、LMWF治疗组和地塞米松(DXM)治疗组,用药7天后评估纤维化相关指标,包括肺组织病理学评估、羟脯氨酸含量、湿干比、BALF和血浆TGF-β1水平;2.利用免疫荧光、流式细胞术、WB等检测肺内M1、M2型巨噬细胞表达、EMT表型蛋白及TGF-β1、p-Smad2/3、t-Smad2/3表达水平。结果:1.光镜下可见LMWF的干预可有效改善小鼠肺组织结构,减轻间质细胞增生及胶原沉积,同时可降低组织羟脯氨酸及BALF、血浆的TGF-β1表达;2.LMWF可有效降低小鼠BALF和肺组织M2型巨噬细胞表达;3.LMWF可有效改善VILI后EMT;4.LMWF可有效抑制VILI小鼠肺组织中TGF-β1、p-Smad2/3的表达。结论:在健康小鼠肺组织中,LMWF可缓解大潮气量通气引起的肺组织EMT,改善VILI后肺纤维化,其机制可能与LMWF抑制M2型巨噬细胞介导的上皮TGF-β1/Smad信号通路活化相关。