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在白蚁巢群中个体密度高、接触频繁、亲缘关系近,有利于致病微生物的传播。为抵御致病菌的侵染,白蚁在行为、生理和空间组织上进化出一系列疾病防御策略,称之为社会免疫。目前,白蚁社会免疫研究主要集中在群体防御疾病的行为和生理变化方面,包括理毛、交哺、隔离、攻击、细胞免疫和体液免疫等。然而,有关白蚁社会免疫分子调控机制方面的研究相对较少。鉴于此,本文以黑胸散白蚁Reticulitermes chinensis Snyder和绿僵菌Metarhizium anisopliae(Metschnikoff)Sorokin为材料开展了本课题研究,主要结果如下:1黑胸散白蚁利用主动免疫抵御绿僵菌的侵染绿僵菌直接感染的白蚁相互接触后,理毛频率显著升高(p<0.05)。在荧光显微镜下发现,无菌同伴白蚁与直接染菌白蚁接触后体表获得少量绿僵菌孢子。受菌同伴白蚁体内菌落单位数显著低于直接染菌白蚁(p<0.01),受菌同伴白蚁的死亡率(13%)低于直接染菌白蚁(50%)。然而,受菌同伴白蚁的抗菌活性、抗氧化酶活性(过氧化氢酶和超氧化物歧化酶)和免疫基因表达量(Phenoloxidase、transferrin和termicin)均显著高于无菌同伴白蚁(p<0.05)。上述结果表明,无菌同伴白蚁通过理毛行为主动获得低剂量的绿僵菌孢子,激活自身免疫系统,使群体中免疫个体数增加,死亡率降低。白蚁使用的这种社会免疫方式与人类使用的“人痘接种”方式类似,因此称之为主动免疫。2黑胸散白蚁主动免疫相关候选蛋白的筛选利用iTRAQ技术,在受菌同伴白蚁体内发现40种蛋白上调,22种蛋白下调。其中20种差异表达蛋白与主动免疫相关,包括12种胁迫蛋白、6种免疫信号蛋白和2种免疫效应蛋白。运用质谱多反应监测(MRM)技术对差异表达蛋白进行验证,发现14种差异蛋白的MRM结果与iTRAQ结果呈显著正相关(R=0.8725,p<0.001),这表明这14种主动免疫相关蛋白的表达结果是可靠的。在14种差异表达蛋白中,5种主动免疫相关蛋白表达差异达到显著水平(p<0.05),包括1种代谢相关蛋白(异柠檬酸脱氢酶alpha亚基,IDH-α),3种胁迫蛋白(谷胱甘肽S转移酶D1、表皮蛋白19和60S核糖体蛋白L23)和1种免疫信号蛋白(泛素结合酶)。其中IDH-α是三羧酸循环(TCA)中重要限速酶“异柠檬酸脱氢酶”的亚基,在白蚁主动免疫过程中显著上调,暗示IDH-α在白蚁主动免疫中可能发挥重要作用,值得进一步探讨。3主动免疫候选蛋白IDH-α对黑胸散白蚁代谢的影响运用RNAi技术沉默IDH-α基因后,白蚁体内IDH-α的mRNA(p<0.05)水平和蛋白表达量均显著下降,异柠檬酸含量显著降低(p<0.05),NADH水平显著升高,表明白蚁体内TCA循环中NAD~+-IDH反应受损。沉默IDH-α基因后,导致白蚁体内糖原、葡萄糖、乳酸和甘油三酯含量显著升高(p<0.05),丙酮酸含量显著降低(p<0.05),表明白蚁体内糖代谢受阻,丙酮酸无法正常进入TCA循环,转而生成乳酸和甘油三脂。沉默IDH-α基因后,白蚁体内游离铬和锰元素含量显著下降(p<0.05),锌元素含量显著上升(p<0.05),铁(p=0.078)和硒(p=0.057)元素含量呈下降趋势,表明白蚁体内游离微量元素出现失衡。沉默IDH-α基因后,白蚁体内精氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸含量均显著下调(p<0.05),氨基酸代谢相关基因表达量显著变化(p<0.05),而尿酸和尿素水平显著增加(p<0.05),表明白蚁体内氨基酸代谢水平增强,补偿性生成α-酮戊二酸,进入三羧酸循环,保证白蚁机体的能量供应。上述结果表明,降低IDH-α基因表达量可以导致白蚁机体出现代谢紊乱。4 IDH-α对黑胸散白蚁主动免疫的调控作用沉默IDH-α基因后,尽管直接染菌白蚁的理毛频率和受菌同伴白蚁的免疫基因表达量无显著变化,但是受菌同伴白蚁的抗菌活性显著下降(p<0.01),死亡率显著增加(p<0.05),表明显著降低IDH-α基因的表达量可以打破白蚁主动免疫。进一步研究表明,沉默IDH-α基因后,受菌同伴白蚁体内Caspase 3酶活显著升高(p<0.05),细胞凋亡相关基因(TNF-α、Caspase 1、Caspase 3和Caspase8)表达量显著上升(p<0.01),ATP含量显著降低(p<0.01);在受菌同伴白蚁的头部、胸部、腹部和肠道中均出现明显的细胞过度凋亡症状,细胞凋亡比率显著升高(p<0.05),肠道内菌落单位数显著升高(p<0.01)。上述结果表明,沉默IDH-α基因可以引起白蚁机体出现代谢紊乱和细胞过度凋亡,使得白蚁肠道更易被绿僵菌侵入和穿透,从而低剂量的绿僵菌侵染也能导致白蚁死亡,由此打破白蚁的主动免疫。综上所述,本研究发现白蚁群体存在一种类似“人痘接种”的主动免疫方式,并阐释了关键代谢基因IDH-α在白蚁主动免疫调控中的重要作用。研究结果在理论上可以丰富昆虫社会免疫学理论,在实践上为提高绿僵菌野外防治白蚁效果提供了新思路。