论文部分内容阅读
背景C型凝集素样受体如NKG2D和CD94/NKG2由于它们共刺激T细胞增殖和细胞因子分泌的能力而被认为是一种新的T细胞刺激分子。C型凝集素家族具有独特的糖基识别结构域（cysteine rich domain，CRD），这种糖基识别结构域被称为C型凝集素样结构域。实验表明，C型凝集素样分子，包括NK细胞受体CD94/NKG2A和NKG2D，NKRP1家族成员和CD69,在先天和适应性免疫反应中扮演重要角色。通过与其配体相互结合，C型凝集素样受体能够在NK细胞和其他细胞中扮演多种角色。C型凝集素受体成员在免疫系统中发挥多种功能，病原体识别调节，NK细胞和T细胞的刺激，细胞运输和骨的形成。破骨细胞抑制凝集素相关蛋白（2osteoclast inhibitory lectinrelated protein2, OCILRP2）是破骨细胞抑制凝集素（OCIL）家族的成员之一,属于Ⅱ型跨膜糖蛋白,具有较小的胞内区和跨膜区, OCIL家族成员的胞外区均包含一个C型凝集素样的结构域。OCILRP2是一种新的C型凝集素。小鼠OCILrP2基因位于6号染色体的NK基因复合体内。OCIL家族包括OCIL(Clrb)、OCILrP1(Clrd)和OCILrP2(Clrg)3个基因,其胞外区具有很高的同源性(约80%)。OCILRP2主要在免疫组织器官中表达,在小鼠脾脏和胸腺中高水平表达，在其他器官如大脑、心脏、肝脏、肾脏、睾丸、肺、胎盘和肌肉等均未检测到OCILRP2的表达；其中主要在B细胞和树突状细胞（DC）中呈高表达，在未活化的T细胞中几乎很少表达,但在T细胞被活化后其表达水平明显上升。初步研究表明, OCILRP2可作为T细胞的共刺激分子,在T细胞的活化过程中发挥一定作用，且OCILRP2是与其配体NKRP1f相互配合在T细胞的活化过程中发挥共刺激作用的。T细胞活化能够快速诱导OCILRP2的产生，并在72小时内保持相当高的水平。OCILRP2的配体NKRP1f在树突状细胞显著表达。可溶性的OCILRP2-IgFc重组蛋白能够在体内和体外显著抑制特异性抗原刺激对T细胞的增殖，白介素2（IL-2）的产生；相反，抗原递呈细胞表达的NKRP1f通过与OCILRP2共刺激增强B7.1/CD28介导的T细胞的增值。但是有关OCILRP2在T细胞共刺激中的作用机制目前尚不清楚。目的探讨OCILRP2-IgFc融合蛋白在哺乳动物中国仓鼠卵巢细胞（CHO）中的稳定分泌表达及其表达产物的纯化和鉴定，利用纯化鉴定后的OCILRP2-IgFc融合蛋白免疫宿主动物制备特异性的抗OCILRP2抗体。方法利用脂质体2000为转染媒介，将OCILRP2-IgFc重组质粒转染哺乳动物细胞CHO细胞，经G418抗性培养基加压筛选、克隆化培养、ELISA测定，获得稳定表达OCILRP2-IgFc融合蛋白的细胞克隆；稳定转染的CHO细胞在培养瓶中扩大培养，适时更换无血清无动物组织培养基，继续培养5-7天后收集培养上清，培养上清经低温高速离心和0.45微米滤膜过滤后上Protein A柱进行亲和层析纯化；利用BCA、SDS-PAGE、Western blot、ELISA、质谱分析等方法对纯化得到的融合蛋白浓度、纯度、分子量、抗原特异性进行测定和鉴定。使用流式细胞术及ELISA等检测方法对获得的重组蛋白OCILRP2的生物学活性进行分析。用纯化得到的OCILRP2-IgFc融合蛋白加弗氏完全佐剂（CFA）或不完全佐剂（IFA）乳化免疫雄性的新西兰白兔制备抗OCILRP2的抗血清，利用饱和硫酸铵（SAS）盐析和ProteinG亲和层析纯化获得特异性抗OCILRP2的多克隆抗体。结果建立稳定分泌表达OCILRP2-IgFc融合蛋白的CHO细胞系。利用Protein A亲和层析纯化获得OCILRP2-IgFc融合蛋白，SDS-PAGE可见两条蛋白主带，一条分子量为55kDa,另一条分子量为40kDa， Western blot可在同样位置检测到该两条蛋白与HRP标记的山羊抗人Ig/Fc抗体特异性结合，将上述两条蛋白条带进行质谱分析均含有OCILRP2和标签Fc的氨基酸序列，证实纯化得到的蛋白为OCILRP2-IgFc融合蛋白。制备的OCILRP2-IgFc融合蛋白能有效抑制T细胞增殖、IL-2的分泌、OCILRP2表达等。ELISA、Western blot均证实制备的兔抗OCILRP2抗体与纯化得到的融合蛋白OCILRP2-IgFc的两个主条带发生特异性结合。结论在CHO细胞中成功地建立了稳定分泌表达OCILRP2-Ig Fc融合蛋白的细胞系；制备了具有生物学活性的重组OCILRP2-IgFc融合蛋白。制备出特异性的抗OCILRP2抗体。