血蓝蛋白是近年来在对虾等无脊椎动物体内新发现的一种具有多种免疫活性的多功能蛋白。有趣的是，课题组前期研究发现，凡纳滨对虾血蓝蛋白大亚基（命名为 HcL）可能至少存在42条变体序列（命名为HcLV），但迄今为止，大部分变体的全长序列及其免疫学功能尚不清楚。为此，本研究在课题组前期已获得的3条变体序列（HcLV1-3)的基础之上，进一步采用分子生物学、免疫学策略对另外两条差异较大的变体序列（HcLV4, HcLV5)进行了深入、系统的研究。所获主要研究结果如下：　　1、2种HcLV全长cDNA的克隆及序列分析　　基于数据库中已知的HcLV4、HcLV5部分EST序列，采取RACE技术，克隆HcLV4、HcLV5 cDNA全长序列，发现HcLV4、HcLV5 cDNA ORF框分别为2219、2137 bp，编码672、678个氨基酸。经BLAST比对，HcLV4、HcLV5氨基酸序列与HcL序列存在90、83％的相似性。两者均具有血蓝蛋白的典型结构，包括铜离子结合区域，保守His位点和Ig-like区等。该结果进一步证实了对虾血蓝蛋白变体的存在，为深入了解对虾血蓝蛋白的免疫防御机制奠定了良好的基础。　　2、2种HcLV DNA序列的克隆及多态性分析　　根据已知的HcLV4、HcLV5 cDNA全长序列，扩增HcLV4、HcLV5 DNA序列，获得HcLV4 DNA5’端序列及HcLV5 DNA全长序列，HcLV45’端DNA全长952 bp，无内含子区域，其与HcLV4 cDNA序列同源性为99%；HcLV5 DNA全长2660 bp，其中含有2个内含子区域，分别位于80-538 bp处（命名为gHcLV5-I-1）和2064-2227 bp处，其外显子区域与HcLV5 cDNA序列同源性为99%。　　在此基础之上，采用文库构建、核酸测序与序列比对等技术进一步对gHcLV5-I-1的多态性进行了进一步的研究。结果发现，该内含子区域具有明显的分子多态性，且不同组织之间存在组织差异性，根据其序列变化规律，所测序列可进一步分为3种亚型。进化分析显示，该3种亚型序列可能通过缺失突变、点突变等基因突变方式演化而来。由此说明，对虾血蓝蛋白大亚基变体序列的多态性来源于其DNA水平，且其内含子同样具有高度的分子多态性。　　3、1种HcLV的原核表达及其免疫学功能研究　　采用原核表达、凝集实验、抑菌实验、RNAi、免疫刺激等技术进一步对HcLV4的免疫学功能进行了进一步的探索。结果发现，HcLV4重组表达蛋白（命名为rHcLV4）分子量为96.3kDa，与预期大小一致，其对副溶血弧菌等3种细菌具有明显的凝集活性，其凝集活性大小为31.25-500μg/ml，约为HcL重组表达蛋白（rHcL）的2-8倍；与rHcL一致，rHcLV4对副溶血弧菌同样具有抑菌活性，且将其注射对虾后，可显著降低对虾感染副溶血弧菌之后的死亡率；不过，与预期不一致的是，HcLV4基因被 RNAi后，对虾感染副溶血弧菌后的死亡率非但没有升高反而明显降低。由此说明，对虾血蓝蛋白变体（HcLV4）在对虾免疫防御中同样具有重要的免疫学功能。　　综上所述，本研究成功克隆得到两条对虾血蓝蛋白大亚基变体HcLV4，HcLV5的核酸序列，其与对虾抵御病原微生物密切相关。所获研究结果，对丰富对虾血蓝蛋白的分子多态性研究，深入揭示血蓝蛋白功能多样性的分子机制，阐明对虾免疫防御机制等具有重要的意义。同时，为选育抗逆优良对虾品种、建立对虾病害的免疫学防治方法等提供了良好的科学依据，促进对虾养殖业的健康、持续发展。