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冬凌草甲素(oridonin)是从冬凌草中分离出来的天然化合物,是冬凌草中最重要的抗癌活性成分,对乳腺癌、前列腺癌、消化道系统癌症和血液系统癌症等细胞具有显著的抑制生长作用,并且其毒性较低,对肝、肾、骨髓等人体重要脏器无明显损伤。研究者在冬凌草甲素对肿瘤细胞周期阻滞方面进行了许多研究,在这些研究中都是直接对细胞进行给药处理,所得到的结果总是差强人意。其原因就在于,当直接给药时,细胞所处时期不同,就会出现细胞敏感程度差异、作用机制有差异、重复性差的问题,导致最终的阻滞效果不能完全体现出药物的作用效果。采用同步化方法研究细胞周期阻滞可以将细胞同步于一个狭窄的时期内,药物对细胞的作用效高度的统一,因而可以准确研究药物的周期阻滞作用,进而深入研究药物对周期内关键点的调控作用。所以本实验基于细胞周期同步化方法,研究冬凌草甲素对人胃癌SGC-7901细胞的阻滞并进一步确定阻滞时期。本实验主要开展了三大方面内容,分别为:(1)建立人胃癌SGC-7901细胞周期同步化模型,其中包括三个小方面,分别是1)采用生长曲线法结合公式推导,测定人胃癌SGC-7901细胞周期时长,2)BrdU-FITC/PI双染,流式细胞术测定S期细胞比例进而推测S期时长,3)PI单染,流式细胞术测定TdR双阻断同步法对细胞周期的同步化作用效果;(2)PI单染,流式细胞术检测冬凌草甲素对细胞周期同步化后的人胃癌SGC-7901细胞的周期影响;(3)Westem Blotting法分析冬凌草甲素对细胞周期相关蛋白Cyclin A和Cyclin B1的影响以确定冬凌草甲素阻滞人胃癌SGC-7901细胞的具体期。实验研究结果表明,(1)计数法分别记录0、24、48、72、96、120、144和168h人胃癌SGC-7901细胞总数,通过Excel制作拟合生长曲曲线与对数期生长曲线,由公式Tc=△t×24h ×Lg2/(LgNt-LgN0)]推导得到Tc=24h/b,计算得出人胃癌SGC-7901细胞对数期细胞周期时长为Tc=30.63h;(2)BrdU-FITC/PI双染,流式细胞仪检测人胃癌SGC-7901细胞S期细胞百分比结果表明,加入BrdU试剂1、3、5和7h后S期的百分比分别为18.5%,20.9%,24.6%,27.8%,据公式推算出S期时长为10.53h;(3)PI单染,流式细胞术测定TdR双阻断法细胞周期同步结果显示,加入终浓度为2mmol/L的TdR于人胃癌SGC-7901细胞,其被同步于G0/G1期,成功建立同步化模型;(4)PI单.染,流式细胞术检测冬凌草甲素同步化于G0/G1,期的人胃癌SGC-7901细胞的细胞周期影响,将细胞同步化后分别加入终浓度为1、2、4、8、16μmol/L的冬凌草甲素,给药24h组与阴性对照组相比,S期细胞比例逐渐升高,百分比分别为28.60%,27.7%,52.6%,60.0%%,59.7%,给药48h组与阴性对照组相比,G2/M期细胞比例逐渐升高,百分比分别为41.5%、46.5%、47.6%、53.7%、56.9%、63.4%,与阴性对照组相比具有统计学意义。表明冬凌草甲素能够对人胃癌SGC-7901细胞的周期产生影响,将SGC-7901细胞阻滞在G2/M期。(5)Westem Blotting法分析冬凌草甲素对细胞周期相关蛋白Cyclin A和Cyclin B1表达的影响结果表明,冬凌草甲素能够影响Cyclin A和Cyclin B1表达,Cyclin B1均表达,而CyclinA则没有表达,表明冬凌草甲素将人胃癌3GC-7901细胞阻滞于M期而不是G2期。本文通过建立细胞周期同步化模型后更清楚地观察了冬凌草甲素能够将人胃癌SGC-7901细胞周期阻滞于G2/M期,并且进一步明确了将人胃癌SGC-7901细胞阻滞于M期。