研究背景及目的感染性休克是由病原微生物感染引起的以发热、寒战、四肢湿冷、皮肤紫绀、心动过速、低血压为主要临床症状及体征的综合征，常伴多脏器功能衰竭，是临床上常见的死亡率高的危重病症。临床上以革兰氏阴性细菌感染最为常见。脂多糖（1ipopolysaccharide，LPS）也称内毒素，可以刺激血液及组织中单核-巨噬细胞释放多种细胞因子。这些炎症介质启动体内的炎症级联反应，导致感染性休克、全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）、多器官功能衰竭，甚至死亡。因此，感染性休克又称之为内毒素休克。目前治疗感染性休克的措施有很多，包括补充血容量、纠正酸中毒、改善微循环、控制感染及抑制炎症介质的释放。其中抑制炎症介质的释放有利于控制全身炎症反应，改善微循环障碍及代谢紊乱，阻止多器官功能衰竭，在抗休克治疗中具有重要作用。事实上，在临床上感染性休克缺乏有效的治疗，因此，寻找有效治疗感染性休克的新药极为重要。大麻是一种古老的植物。早在数千年前，大麻作为麻醉品广泛使用。尽管大麻具有止痛、镇静等多种药理作用，但因成瘾性，其使用受到严格限制。大麻素（cannabi-noid，CB）是大麻的主要活性成分。近年来，研究发现大麻素除了具有大麻的止痛、镇静的药理作用外，还能调节食欲、调节脂肪代谢、调节血压及调节免疫，且对心脏及神经具有保护作用。研究也发现体内存在两种CB受体，即CB₁受体和CB₂受体。大麻素通过作用于CB受体发挥上述作用。CB₁受体主要分布在脑、脊髓与外周神经系统中，与记忆、认知、成瘾性、运动控制有关；CB₂受体在免疫组织中有丰富的表达，介导免疫调节作用。研究者就大麻素对免疫的调节进行了大量的研究，多数研究显示大麻素具有免疫抑制作用，少数研究提示大麻素促进免疫反应。大麻素对免疫的调节大致可分为四个途径，即：（1）诱导细胞凋亡；（2）抑制细胞增殖和分化；（3）抑制细胞因子和趋化因子的生产；（4）诱导调节性T细胞（Tregs）。细胞凋亡是机体为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。凋亡包括细胞形态（如细胞缩小、核碎裂染等）和分子（如含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶caspases和细胞色素）的改变。大麻的主要活性成分四氢大麻酚（Tetrahydrocannabinol，THC）属于非选择性CB受体激动剂，通过CB₁和CB₂受体发挥作用。研究证实THC能促进脾细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞的凋亡，进一步研究发现THC的这种促凋亡作用与Bcl-2和caspase-1活性的改变有关；非选择性CB受体激动剂大麻二酚也可通过增强反应性氧化物的生成和caspase-3和8的活性诱导CD4+和CD8+T细胞凋亡。研究还发现大麻素抑制细胞凋亡。选择性CB₂受体激动剂JWH-015除了抑制T淋巴细胞凋亡，还能抑制B淋巴细胞和胸腺细胞的凋亡，并且深入研究发现caspase-3、8和9参与细胞的凋亡。这些研究说明大麻素可改变caspases的活性及氧化物的生成，进而调节细胞凋亡。研究者发现非选择性CB受体激动剂anandamide和选择性CB₂受体激动剂JWH-015抑制T和B淋巴细胞增殖，但是也有研究者发现小剂量的非选择性CB受体激动剂CP55940、WIN55212-2和Δ9THC能促进人扁桃体B淋巴细胞的增殖。且CP55940的促增殖作用能被选择性CB₂受体拮抗剂SR144528抑制，却不能被CB₁受体拮抗剂SR141716A阻断。此外，2-arachidonylglycerol （2-AG）能诱导HL-60细胞分化巨噬细胞样细胞，并且SR144528能抑制非选择性CB受体激动剂2-AG的这种诱导分化作用。这些研究提示大麻素双向调节免疫细胞的增殖和分化，且CB₂受体可能介导该免疫调节作用。大量研究还发现大麻素调节多种炎症介质的生成。例如，大麻的主要活性成分THC抑制人的B细胞产生IL-8和巨噬细胞炎性蛋白-1（macrophage inflammatoryprotein，MIP-1）；抑制NK细胞产生TNF-α、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）、干扰素-γ（interferon，IFN-γ）、MIP-1α、MIP-1β和IL-10；抑制嗜酸性粒细胞产生IL-8、MIP-1α和MIP-1β。在嗜肺军团病杆菌感染模型中，THC可抑制Th1细胞因子IFN-γ及IL-12的生成，促进Th2细胞因子IL-4和IL-10的生成，致使Th细胞的分化向Th2细胞偏移，促进Th2细胞辅助的体液免疫应答。在LPS诱导的发热模型中，非选择性CB受体激动剂WIN55212-2能降低该模型小鼠的血清IL-6水平，并且能缓解LPS诱导的发热。这些研究提示大麻素能抑制炎症因子的生成。在非致死剂量嗜肺性军团杆菌感染模型中，THC可促进急性期炎症因子TNF-α和IL-6的释放，研究提示THC能促进炎症因子的生成。大麻素虽具有多种药理作用，但因其成瘾性，其临床应用受到一定限制。选择性CB₂受体激动剂能特异性结合CB₂受体，发挥免疫调节作用，而又无成瘾性，是一类非常有临床应用前途的化合物。在组织损伤模型中，选择性CB₂受体激动剂HU-308不仅能抑制趋化因子单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein, MCP-1）、TNF-α、IL-1β和细胞黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1, ICAM-1）在肾脏组织的表达，减少顺铂对肾脏的损伤；还能抑制小鼠血清及肾脏组织中生成TNF-α、MCP-1α和MCP-2，对肾脏缺血再灌注损伤具有保护作用。上述研究说明大麻素能够调节炎症过程中炎症因子的生成。但炎症因子相互调节、相互调控、相互影响，炎症因子的调节极为复杂。一些研究提示大麻素抑制炎症因子的生成，另一些研究提示大麻素促进炎症因子的生成，大麻素具有促炎作用还是抑炎作用仍有争议。本课题研究CB受体激动剂拮抗内毒素休克的作用及机制。明确CB受体激动剂对内毒素休克的调节及CB₂受体是否参与内毒素休克的调节。研究方法1体内实验取体重约20²5g的雄性野生型小鼠（C57BL/6小鼠）和CB₂-/-小鼠，腹腔注射LPS溶液，制备内毒素休克模型。观察野生型小鼠和CB₂-/-小鼠内毒素休克24h生存率。2体外实验（1）腹腔巨噬细胞的分离、培养与活化每只C57BL/6小鼠腹腔注射2ml/日的3%肉汤基，连续3天后引颈处死小鼠；在无菌条件下分离出小鼠腹腔巨噬细胞，调整细胞密度，接种细胞悬液至6孔板或96孔板（6孔板细胞密度为6×106/ml，96孔板细胞密度为2×106/ml），在孵箱孵育2h后，1×PBS液洗涤一次，换液，置于孵箱过夜。（2）腹腔巨噬细胞的干预第5日将培养的腹腔巨噬细胞换液后，先加入不同浓度的非选择性CB受体激动剂WIN55212-2或选择性CB₂受体激动剂HU-308，15min后再加入10ng/ml LPS。未予任何干预的腹腔巨噬细胞作为阴性对照组；只予LPS的腹腔巨噬细胞作为阳性对照组。（3）细胞因子基因表达量的测定在加入10ng/ml LPS3h后，用Trizol裂解液裂解腹腔巨噬细胞，抽提总RNA。再将总RNA逆转录成cDNA，然后用RT-PCR和实时定量RT-PCR （qRT-PCR）检测样品中TNF-α mRNA和IL-6mRNA的表达量。（4）细胞因子蛋白表达量的测定在加入10ng/ml LPS24h后，收集培养上清液，参照厂商说明书用ELISA检测上清中IL-6蛋白的浓度。研究结果（1）在LPS（15mg/kg）诱导的内毒素休克模型中，野生型小鼠和CB₂-/-小鼠均出现竖毛，眼泪分泌增多，腹泻及行动迟缓等典型的休克症状，但CB₂-/-小鼠的休克症状更为严重。CB₂-/-小鼠在腹腔注射LPS（15mg/kg）1h内开始死亡，其24h生存率只有46.7%；腹腔注射LPS（15mg/kg）的野生型小鼠没有死亡，其24h生存率100%。该结果表明CB₂受体通路具有降低LPS诱导的内毒素休克死亡率，即提示CB₂受体通路可能对内毒素休克具有防治作用。（2）RT-PCR结果显示，3μM WIN55212-2可显著减少LPS活化的腹腔巨噬细胞表达促炎细胞因子TNF-α mRNA和IL-6mRNA的水平；0.3μM WIN55212-2可显著增加LPS活化的腹腔巨噬细胞表达促炎细胞因子TNF-α mRNA和IL-6mRNA。qRT-PCR结果进一步显示，3μM WIN55212-2组的TNF-α mRNA表达量只有LPS阳性对照组的一半；0.3μM WIN55212-2组的TNF-α mRNA表达量比LPS阳性对照组高出1倍多，提示WIN55212-2能双向调节LPS活化的腹腔巨噬细胞表达TNF-αmRNA。3μM WIN55212-2组表达IL-6mRNA只有LPS阳性对照组的1/3；0.3μM和1μM WIN55212-2组IL-6mRNA的表达明显高于LPS阳性对照组，0.3μMWIN55212-2组的IL-6mRNA表达量是LPS阳性对照组的约2.5倍，1μM WIN55212-2组的IL-6mRNA表达量是LPS阳性对照组的2倍，提示WIN55212-2也能双向调节LPS活化的腹腔巨噬细胞表达IL-6mRNA。（3）ELISA结果示：3μM WIN55212-2组上清液中IL-6蛋白的含量只有LPS阳性对照组的1/3；0.3μM和1μM WIN55212-2组上清液中IL-6的含量明显高于LPS阳性对照组，0.3μM和1μM WIN55212-2组上清液中IL-6的含量分别是LPS阳性对照组的4、2倍，研究结果提示：WIN55212-2也能双向调节LPS活化的腹腔巨噬细胞上清液中IL-6蛋白的含量。（4）HU-308对LPS活化的腹腔巨噬细胞生成的炎症因子的调节与WIN55212-2一致，RT-PCR结果显示，3μM和10μM的HU-308可显著减少LPS活化的腹腔巨噬细胞表达促炎细胞因子TNF-α和IL-6mRNA；0.3μM的WIN55212-2可显著增加LPS活化的腹腔巨噬细胞表达TNF-α和IL-6mRNA。qRT-PCR结果进一步显示，3μM和10μM HU-308组TNF-α mRNA的表达量明显较LPS阳性对照组低，10μMHU-308组的TNF-α mRNA表达量只有LPS阳性对照组的1/3，3μM HU-308组的TNF-α mRNA表达量只有LPS组的1/2；0.3μM HU-308组的TNF-α mRNA表达量比LPS阳性对照组高2倍，研究结果表明：HU-308能双向调节LPS活化的腹腔巨噬细胞表达TNF-α mRNA。3μM和10μM HU-308组的IL-6mRNA表达量明显低于LPS阳性对照组，3μM和10μM HU-308组表达的IL-6mRNA只有LPS阳性对照组的1/4，0.3μM HU-308组的IL-6mRNA表达量是LPS阳性对照组的约2倍。研究结果提示：HU-308也能双向调节LPS活化的腹腔巨噬细胞表达IL-6mRNA。（5）ELISA结果示：0.3μM HU-308组上清液中IL-6的含量明显高于LPS阳性对照组，0.3μM HU-308组上清液中IL-6的含量是LPS阳性对照组的约5倍；3μM和10μM HU-308组上清液中IL-6的含量只有LPS阳性对照组的1/3，研究结果提示：HU-308也能双向调LPS活化的腹腔巨噬细胞上清液中IL-6蛋白的含量。研究结论：1CB₂受体的完整性能减少LPS诱导的内毒素休克的死亡率，提示CB₂受体通路可能具有防治内毒素休克的作用。2CB受体激动剂双向调节LPS活化的腹腔巨噬细胞产生促炎细胞因子TNF-α和IL-6，CB₂受体参与此免疫调节作用。