胶质瘤是发生于神经外胚层的肿瘤,是颅内恶性肿瘤中最常见的一种。因其具有侵袭性生长的特性,手术难以完全切除,术后复发率高,至今术后辅以必要的化疗仍是很重要的方法。目前,胶质瘤的常规化疗药物,易导致中枢神经系统甚至全身的毒副作用,使它们的应用受到限制,故寻求一种高效低毒、特异性高、不易发生耐药的抗胶质瘤药物有重要意义。随着分子生物学和细胞生物学的进展,对胶质瘤的化疗也有了许多新的机制。自从1972年Kerr【1】等人提出了细胞凋亡这一概念后,肿瘤细胞凋亡的形成、发展及诱导肿瘤细胞凋亡日益得到众多学者的重视。雷公藤已被大量实验证明可诱导多种肿瘤细胞凋亡,其主要活性成分雷公藤甲素(TP)发挥着重要作用。TP(C20H24O6)是一种还氧二萜内酯化合物,分子量为360。目前国内尚无对TP诱导胶质瘤细胞凋亡的研究及其机制的详尽报道。本实验通过体外培养C6胶质瘤细胞,设置实验组及对照组分别进行HE染色、透射电镜观察、hochest荧光染色、MTT法和流式细胞仪检测等方法,旨在证明TP对C6胶质瘤细胞有明显的生长抑制及诱导其凋亡的作用,为临床药物提供了实验基础研究。本实验研究结果如下:1、经HE染色的对照组细胞可见其体积大,形态呈多边形或不规则形,胞浆丰富,呈淡紫色,细胞核大,圆形,呈淡蓝色;而实验组细胞聚集成团块,细胞体积缩小,呈圆形,细胞核缩小,核分裂像较多,靠近细胞边缘,深染,呈蓝黑色;胞质呈红色。2、电镜检测见对照组C6细胞整体结构清晰完整,细胞形态不规则,细胞表面可见微绒毛结构,细胞核较大,核质比较大,核仁明显。细胞质内可见到许多细胞器。实验组细胞则呈凋亡形态学改变,细胞整体显得致密暗淡,表面的微绒毛消失,细胞核极不规则,细胞体积明显变小,变圆,细胞核内染色质离散,细胞体和细胞核均缩小,核内染色质呈颗粒状或块状凝聚在核膜下。内质网、线粒体膜碎裂呈空泡状,胞质内空泡明显增多。3、Hoechst染色结果: TP浓度为3.2 umol/L作用24小时后,细胞密度降低,胞核变小,形态不规则,细胞核碎裂,呈散点状分布;对照组细胞细胞密度较大,胞核大,饱满,核内染色质分布均匀。4、本实验中MTT法检测不同药物浓度的TP对C6有明显的生长抑制作用,并呈现出时间、浓度依赖性。5、通过FCM的检测, TP显著的增加了G2-M期中的细胞比例,同时降低了G0-G1期和S期的细胞数量,细胞凋亡率也明显增加。对照组G0-G1期细胞比例为65.19±4.28%,而实验组G0-G1期细胞比例为49.3±3.92%,对照组G2-M期细胞比例为9.18±0.38%,而实验组G2-M期细胞比例为32.83±2.08%,对照组S期细胞比例为24.63±2.96%,实验组S期细胞比例为16.21±1.01%。对照组细胞凋亡率为12.63±2.04%,实验组细胞凋亡率为22.67±2.90%,由于大量细胞被阻滞在G2-M期,从而不能进行细胞的有丝分裂,细胞增殖受到限制。细胞凋亡的检测可以反应出细胞经TP作用后,细胞凋亡数量增多,由此导致了细胞数量大大降低。结论1、雷公腾甲素(TP)具有体外抑制C6细胞增殖的抑制作用,并呈时间、药物浓度依赖性。2、TP具有诱导C6细胞凋亡的作用。3、TP可将C6阻滞于G2-M期,从而不能进行细胞的有丝分裂,细胞增殖受到限制。本实验的创新性1、证实了TP具有体外抑制C6细胞增殖的作用,并呈时间、浓度依赖性。2、证实了TP可以在体外诱导C6细胞凋亡,并将大量细胞阻滞于G2-M期。