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种子特异性启动子能够驱动外源基因只在植物种子中大量表达,外源基因组织特异性转录活性的高低通常由启动子上的顺式作用元件来参与调控。研究表明,ABRE元件是与种子特异性表达相关的元件,因此,对该元件进行功能初析,能够为后续更加深入的研究种子特异性启动子的调控机理奠定基础。拟南芥At3g21380基因是一种甘露糖结合蛋白编码基因,实验室之前研究结果证明该基因启动子为种子特异性启动子。此外,对该基因启动子上的顺式作用元件分析结果还表明:在启动子中存在ABRE元件和RY元件、skn-1元件、GCN4元件等与种子特异性表达相关的顺式作用元件。在本项研究中,为了明确ABRE元件对At3g21380启动子种子特异性转录活性的影响,首先通过设计ABRE元件的突变位点及特异性PCR扩增引物,克隆得到突变启动子片段,然后将目的片段连接到植物基因表达载体上。利用农杆菌介导的浸花法将验证正确的表达载体转化野生型拟南芥。收获浸染后的拟南芥种子进行潮霉素抗性筛选实验。将筛选之后得到的转基因纯系拟南芥进行PCR鉴定,最终获得含有正确突变启动子片段的转基因纯系拟南芥。对野生型及突变启动子片段的转基因纯系种子进行GUS染色、GUS酶活以及半定量RT-PCR检测分析,并对其他组织包括幼苗、花和角果也进行了GUS染色分析。本项研究的主要结果如下:(1)成功克隆At3g21380突变启动子片段。At3g21380启动子序列分析结果表明在启动子中存在两个ABRE元件,分别命名为ABRE1和ABRE2。基于此,我们设计相应的突变引物分别进行PCR扩增。扩增产物经电泳检测正确后,对目的片段进行回收纯化,从而分别获得了含有ABRE1元件突变的启动子片段和ABRE2元件突变的启动子片段,将它们分别命名为MUTABRE1和MUTABRE2。(2)成功构建At3g21380突变启动子片段表达载体,并筛选获得转基因纯合株系。将上述获得的MUTABRE1和MUTABRE2启动子片段分别连接到相应表达载体上,并经抗生素筛选和双酶切电泳检测,筛选得到阳性克隆。阳性克隆测序结果表明,扩增的MUTABRE1和MUTABRE2启动子片段序列与目的序列一致,因此两个含ABRE元件突变启动子的重组植物表达载体均构建成功。通过农杆菌介导的浸花法,将含突变启动子的植物表达载体分别转化野生型拟南芥。通过潮霉素抗性筛选实验以及PCR鉴定实验鉴定并获得了正确的含突变启动子的转基因纯合株系。(3)初步明确了At3g21380启动子ABRE元件功能。分别对含有ABRE元件突变启动子和含有野生型启动子的转基因纯合株系种子进行GUS组织化学染色分析。结果发现,与含有野生型启动子的转基因株系中有明显染色现象相比,在含有突变启动子的转基因种子中未有肉眼可见的染色现象。因此,染色结果初步表明ABRE元件能够促进At3g21380启动子的种子特异性转录活性。通过进一步定量测定突变及野生型启动子转基因株系种子中的GUS蛋白表达活性,发现在突变启动子转基因种子中的GUS蛋白表达活性均明显低于野生型启动子,并且ABRE1元件突变启动子在种子中启动的GUS蛋白表达活性低于ABRE2元件突变启动子。此结果不仅再次表明ABRE元件在At3g21380启动子的种子特异性转录活性中起正调控作用,还表明在对At3g21380启动子种子特异性转录活性作用上,ABRE1元件比ABRE2元件的促进作用更强。之后又通过半定量RT-PCR实验对GUS基因表达水平进行检测,发现两个突变启动子在种子中启动GUS基因的表达量均明显低于野生型启动子,ABRE1元件突变启动子在种子中启动GUS基因的表达量低于ABRE2元件突变启动子,进一步表明上述实验结论的正确性。