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随着新的RNA病毒的不断出现，人们对RNA病毒的适应性变异问题越来越关注。黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)卫星RNA作为一类与植物病毒相关的特殊的RNA因子，是基因组最小、生物学功能最简单的分子体系，因而被越来越多的研究者用作研究RNA病毒变异的良好模型。本研究通过卫星RNA的基因克隆和序列比较，利用体外转录和体外重组技术的建立，并通过构建卫星RNA人工突变体，实现了卫星RNA基因变异规律和进化趋势的摸索。研究结果如下： 在杭州郊区田间的辣椒植株上分离获得了2株CMV毒株，经dsRNA分析发现均具有典型的卫星RNA条带，并通过RT-PCR获得卫星RNA的全序列。经过序列分析，发现来自HZ03P09分离物的satC336由336个核苷酸组成，来自HZ03P10分离物satC382由382个核苷酸组成。对47个来自不同地区和寄主来源的卫星RNA序列进行同源性分析，发现CMV卫星RNA的序列同源性与地区分布有一定的关联，与其大小、寄主来源等没有明确的关联性。卫星RNA序列之间表现出较大的变异性，卫星RNA的5′端80个碱基和3′端的200个碱基为高度保守区，变异主要发生在几个集中的区域内，变异区内2／3的卫星RNA具有连续的碱基插入或缺失，点变异的碱基或位点在所有卫星RNA中基本相同。由同源性比较结果推断，CMV卫星RNA的最长理论长度至少为425nt，具有人为加长的可能性，而目前的小卫星RNA基本已达到了理论最小。 在5′端添加了T7启动子的PCR产物作为DNA模板，体外转录获得侵染性CMV卫星RNA，通过转录产物与CMV基因组RNA的混合接种建立体外重组技术，并对不同的黄瓜花叶病毒毒株与不同卫星RNA之间的相互选择关系进行了研究。2株CMV病毒分离物CFq和CNa，分别与satRNA satY369进行体外重组，结果显示CNa可支持satY369的复制，而CFq不支持satY369。4个不同来源的卫星RNA(satY369、satY385、satC336和satC382)分别与CNa进行重组，结果表明：CNa可使satY369、satY385、和satC382达高拷贝量并与之稳定共存，但不能稳定支持satC336。2个卫星(satY369、satY385)同时与CNa进行重组，结果表明仅satY369可与CNa稳定共存，而且satY369与CNa的假重组组合(NY)在5种寄主植物内可长期共存，遗传稳定。由此可见，satRNA依赖CMV进行复制的选择关系，不仅与CMV毒株有关，而且与satRNA本身的序列和空间结构有直接关系。 为了解卫星RNA对辅助病毒的影响，通过测定CNa和NY(satY369与CNa的摘要重组毒株)这2个病毒株的寄主反应，结果发现:satY369能明显减弱CNa对大部分寄主植物的症状，尤其是对西葫芦的减弱作用最明显。用RNA点杂交法定量分析寄主植物中CMV的基因组RNA3及satRNA的相对含量变化，结果显示:在26℃条件下，分别定量接种CNa和NY于心叶烟，接种sd、1 od、1 sd、20d、25d和30d时，二者基因组RNA3含量均呈下降趋势，在相应的时间内NY-RNA3含量均低于CNa-RNA3的含量;接种1 od，NY与CNa的寄主适应性没有显著差异，新毒株NY的基因组RNA3在六种寄主植物中的相对含量依次为番茄>假酸浆>心叶烟>西葫芦>南瓜>曼陀罗，其卫星RNA一satY369在寄主中的相对含量则表现为假酸浆>心叶烟>番茄>曼陀罗>西葫芦>南瓜。由此可以看出，卫星RNA一satY369降低了CMV基因组RNA3在寄主中的含量，而且随着接种时间的增加，satY369的对CMV的作用达到平衡期;satY369没有改变CMV基因组RNA3的寄主适应性，而且症状改变与降低基因组RNA含量间没有明确的相关性。 根据以上结果，以satY369为模板，设计了理论最大和理论最小卫星RNA。理论最大卫星RNA Max由421个核普酸组成，理论最小卫星RNA而n由330个核昔酸组成。人工合成片段通过PCR扩增整合，经限制性内切酶酶切和连接酶连接，构建获得插入有理论卫星全基因的质粒pM和pm。将理论卫星与CNa进行体外重组，结果表明:理论卫星RNA不能以CNa为辅助病毒进行有效的复制和装配。当理论卫星与NY进行体外重组，发现在satY369存在时，理论卫星在寄主中略有扩散，但无法长距离传播;理论卫星与satY369不发生重组。由于本实验中理论卫星与其他CMV毒株未进行假重组实验，因而其他CMV毒株对理论卫星RNA的支持能力还没有证据证实。 本研究还利用DNA改组技术，获得4株点突变株—MS一l(巧A~G)、MS一12 (304A~G)、MS一32(304A一T)和MS一34(163G一A)。通过体外重组的方法，对基于卫星RNAsatY369产生的4株突变株的体外进化进行了研究。研究结果表明，在卫星RNA的高度保守区域突变的突变株MS一l、MS一12和MS一犯均丧失生物活性，而变异区中的变异株MS一34突变仍然具有生物活性:从而证实DNA改组技术与体外重组技术的组合可模拟卫星RNA的体内变异和进化。