【摘 要】
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木质素主要由紫丁香基(S),愈创木基(G)和对羟基苯基(H)单元组成,三种基本结构单元通过多种化学方式相互交叉偶联,其中β-O-4醚键的数量占所有连接方式的50%～70%。因此β-O-4醚键的断裂对生物降解木质素至关重要。Sphingobium sp.strain SYK-6是研究最多的细菌之一,其中以谷胱甘肽(GSH)为辅酶的β-醚酶(LigF)代谢途径起着至关重要的作用,已经引起广泛的关注和研
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木质素主要由紫丁香基(S),愈创木基(G)和对羟基苯基(H)单元组成,三种基本结构单元通过多种化学方式相互交叉偶联,其中β-O-4醚键的数量占所有连接方式的50%～70%。因此β-O-4醚键的断裂对生物降解木质素至关重要。Sphingobium sp.strain SYK-6是研究最多的细菌之一,其中以谷胱甘肽(GSH)为辅酶的β-醚酶(LigF)代谢途径起着至关重要的作用,已经引起广泛的关注和研究,β-醚键断裂效率直接影响了木质素的生物降解。Kate E.Helmich团队已经成功报道了 LigF的晶体结构,对LigF进一步研究具有重要意义。本研究中针对LigF体外酶催化反应,建立了一套高通量、快速筛选方法。通过构建LigF突变体库,筛选不同酶活性的突变体菌株,并进行高效液相色谱(HPLC)校正。利用分子动力学模拟对酶活性具有差异的突变体进行分析研究,从中理解其催化机制。1、本研究中利用模型化合物1-(3,4-二甲氧基苯基)-2-(2-甲氧基苯氧基)-1,3-丙二醇(GVL)为初始底物,在Ca-脱氢酶(LigD)催化下生成LigF底物1-(3,4-二甲氧基苯基)-3-羟基-2-(2-甲氧基苯氧基)丙酮(GVG),利用薄层层析硅胶板进行刮板回收,并通过HPLC进行检测,纯度约为98.2%,浓度为20mM。由于LigF催化过程消耗GSH,通过检测体系中GSH残留量表征酶活性高低,根据这一特性建立了针对LigF高通量、快速筛选方法。2、利用易错PCR进行LigF突变体库构建,通过对比酶切构建及环形突变构建效率,发现环形突变构建方法转化效率及突变成功率均高于酶切构建方法,利用环形突变构建方法完成突变体库构建。利用高通量、快速筛选方法对突变体库进行筛选,并利用HPLC对筛选到的突变体进行校正,得到酶活性具有显著差异的突变体。其中突变体AA4表现为酶活性提高,其余突变体表现为酶活下降。表观动力学常数测定,突变体AA4催化效率约为LigF的3.6倍,其余突变体均有不同程度下降。3、对差异突变体F1、F6、AA4、AE4及原始LigF进行分子对接及分子动力学模拟分析。LigF与底物小分子结合力主要为氢键作用,而突变体AA4与底物小分子结合力主要为疏水作用力与氢键作用,由于底物分子也呈现疏水性,使两者更容易结合,便于反应的发生。对突变体进行
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