α-突触核蛋白(α-Synuclein)是一种由140个氨基酸残基组成的天然无结构蛋白,其聚集物是帕金森综合征病理标志物——路易小体的主要成分。因此,α-突触核蛋白被认为与帕金森综合症的发病机制密切相关,引起广泛关注并成为研究热点。线粒体是一种由两层膜结构包被的真核细胞器,它是细胞呼吸作用通过氧化磷酸化合成三磷酸腺苷(ATP)的主要场所,能提供细胞生理活动所需的能量,也被称为细胞的“Power House”。同时,线粒体还参与了其他诸多细胞进程,如细胞间的信息传递、细胞分化和细胞凋亡。线粒体功能异常则与多种疾病相关,如癌症、衰老、炎症、神经退行性疾病等,其中就包括帕金森综合症。据统计全球约有500万帕金森病患者,大量科学家致力于研究该疾病的发病机理并研发有效的治疗方法,而研究α-突触核蛋白与线粒体膜的相互作用,以及在线粒体中开展α-突触核蛋白的原位研究是了解该疾病发病机制的重要途径,对于疾病的认识与治疗具有重要意义。另外,随着蛋白质科学研究的发展与深入,科学家们越来越关注蛋白质在其发挥功能的细胞乃至亚细胞中的表现与功能,在线粒体中展开蛋白质的原位研究也可以为未来蛋白质研究提供一种新方法。核磁共振技术可以非破坏性和非侵入性的获取蛋白质原子水平信息,是线粒体内蛋白质原位研究的有力工具。但如何引入标记蛋白以及标记策略的合理选择,尚缺乏全面且系统的研究。我们通过核磁共振方法研究了 α-突触核蛋白与分离提取的大鼠肝区的完整线粒体的相互作用,发现α-突触核蛋白N端前60个氨基酸残基能与完整线粒体的外膜相互作用,这与当前通过模拟线粒体外膜成分研究两者相互作用所得的不能相互作用的结论并不相同,这可能是因为α-突触核蛋白与线粒体外膜的作用不仅依赖于膜组分,可能也和膜的曲率或膜上其他组分(如脂蛋白、糖等)相关,而这些是模拟膜所不易体现的。另外,我们将电穿孔方法和核磁共振方法结合起来,发展了适合于线粒体内蛋白质原位研究的核磁共振方法。我们成功地通过电穿孔方法将不同同位素标记(主要有19F、13C、15N)的α-突触核蛋白导入线粒体中,且所导入的蛋白质浓度能够达到核磁共振实验检测灵敏度的要求,电转后线粒体也能维持其正常形态结构与膜电位的正常。我们获得了 α-突触核蛋白在大鼠肝脏线粒体中的高分辨1H-15N HMQC谱图,1H-13C HMQC谱图,以及标记α-突触核蛋白在线粒体内的一维19F谱。这些谱图的获得为在线粒体内开展基于不同标记的蛋白质功能研究奠定了基础。我们详细分析了α-突触核蛋白与其突变体在线粒体中的1H-15N HMQC谱图,发现相比于稀溶液,该蛋白在线粒体内N端与C端的信号出现了明显的消失或减弱,其次39号位酪氨酸附近的信号消失也非常显著。这些变化可能与蛋白质在线粒体内发生的各类相互作用相关,如与线粒体内膜,线粒体内的分子伴侣等的相互作用,以及与线粒体环境中的生物大分子的静电相互作用等。综上所述,本研究建立了蛋白质与完整线粒体的相互作用,线粒体内蛋白质原位研究的核磁共振研究方法,这为进一步开展线粒体原位蛋白质研究,如蛋白质相互作用,蛋白质结构及功能等提供了有效方法。