生物体外构建跨膜信号转导体系的初步研究

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本研究以金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)受体组氨酸蛋白激酶AgrC感受外部信号并传递给细胞内的信号转导体系为模拟原型,于特定的条件下,在人工双层膜囊泡中插入仿照跨膜区域设计合成的多肽,构建了研究金黄色葡萄球菌群体感应信号转导机理的初级人工细胞信号转导体系。首先,利用DNAStar分析软件对不同agr(accessory gene regulator,agr)型的金黄色葡萄球菌的氨基酸序列的同源性作了分析,结果表明,AgrC是一个受体组氨酸蛋白激酶,包含一个氨基端的跨膜区和一个细胞内的组氨酸蛋白激酶域,能够被同源或非同源AIPs激活或抑制;利用TMpred和TMHMM软件对不同agr型的金黄色葡萄球菌的跨膜结构作了分析,确定了受体蛋白AgrC与其配体AIP的作用位点,为构建人工细胞膜体系提供理论基础,也为下一步研究AgrC蛋白的激活和抑制提供理论依据。其次,采用化学合成法从十六烷基胺和十六烷基溴两种原料出发,经过取代、缩合等五步反应合成了阳离子型肽脂质溴化N,N-二-十六烷基-Nα-6-三甲胺基己酰-L-丙氨酰胺(N+C5Ala2C16),为制作人工膜准备了材料。并针对合成中分离纯化过程复杂和产率太低的问题,对合成过程尤其是产物纯化方法进行了改进,使合成过程简捷、高效,肽脂质合成量可以不受纯化方式的限制,合成总产率由4.75%提高到了23%。最后,通过分析,设计并合成了agrⅠ型金黄色葡萄球菌ATCC 6538六个跨膜区中与信号转导机理研究最密切的一段氨基酸序列并进行修饰,将此多肽采用超声法镶嵌到人工细胞膜上,采用透射电镜和原子力显微镜对其形态进行了分析,发现囊泡及镶嵌体系的单个形态,大部分为均一球状,直径大小在50~200 nm范围内。针对悬浮液pH、体系温度及浓度等因素对其稳定性的影响做了研究,发现在pH为7.0,温度不超过30℃,多肽和N+C5Ala2C16的摩尔比为1:100时,镶嵌体系的稳定性最强。同时,通过圆二色谱、差示扫描量热分析等手段对镶嵌模型进行表征,分析发现多肽KKK-IFPSFFVVYVTISIL FSYII-KKK能稳定的插入双层膜囊泡中,且能主动的插入形成镶嵌体系。
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