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目的:在中枢神经系统中,谷氨酸是主要的兴奋性神经递质之一,也是一种潜在的神经毒素。正常状况下,神经元细胞内外谷氨酸浓度相差万倍以上。细胞内的谷氨酸主要存在于谷氨酸能神经末梢囊泡内,当神经末梢去极化而兴奋时,囊泡内的谷氨酸就会通过钙离子依赖方式释放。生理条件下,由于体内高效能的谷氨酸摄取系统的存在,使细胞外的谷氨酸维持在较低的水平,仅有少量作为兴奋性神经递质参与信号传递。细胞外谷氨酸低浓度的维持主要依赖于Na+依赖的谷氨酸转运体(又称兴奋性氨基酸转运体,excitatory amino acid transporters, EAATs)将其摄入胶质细胞和神经元内。目前已克隆得到5种不同的EAATs,分别为EAAT1、EAAT2、EAAT3、EAAT4和EAAT5,其中胶质细胞转运体EAAT1和EAAT2分别又叫作谷氨酸天冬氨酸转运体(glutamate aspartate transporter,GLAST)和谷氨酸转运体-1(glutamate transporter-1,GLT-1)。EAAT3又被称为兴奋性氨基酸载体-1(excitatory amino acid carrier 1,EAAC-1)。谷氨酸转运体的主要功能就是将细胞外的谷氨酸摄取到细胞内,维持细胞外谷氨酸处于低浓度。研究表明,胶质细胞谷氨酸转运体,特别是GLT-1在清除细胞外谷氨酸、维持其处于低浓度方面发挥主要作用。根据其羧基端不同,GLT-1存在三种剪接变异体,分别为GLT-1a,GLT-1b和GLT-1c。GLT-1a在大鼠的脑组织中表达丰富,在海马占总GLT-1的90%左右。我室最近研究表明,GLT-1在CIP诱导的脑保护机制中发挥重要作用。但是,GLT-1的剪接变异体GLT-1a在CIP诱导的脑保护机制中作用如何,尚未见报道。研究GLT-1a在CIP诱导的脑保护机制中的作用的一个重要策略是阻断其表达和功能。但是目前尚未发现GLT-1a的特异性阻断剂。反义核酸技术主要根据Watson-Cricker碱基互补原理,合成一段与靶基因具有互补序列的DNA或RNA片段,使之与特定的靶基因或mRNA形成杂交链,从而选择性地封闭靶基因表达。反义寡核苷酸(antisense oligodeoxy-nucleotides,AS-ODNs)是一段14～23碱基长的人工合成单链核苷酸片段,可以选择性和特异性地阻断目的基因的表达。反义寡核苷酸设计的关键是如何在mRNA链上选择最佳作用位点。本实验针对GLT-1a mRNA羧基末端的特异序列进行GLT-1a AS-ODNs设计,利用western blot技术对所设计的AS-ODNs进行筛选与效果评价,为研究GLT-1a在CIP诱导的脑保护机制中作用提供实验依据。1 GLT-1a AS-ODNs的设计根据GLT-1a mRNA羧基末端的特异序列,应用IDT公司的Antisense design software设计了5条GLT-1a AS-ODNs,5条GLT-1a AS-ODNs依次简称为P1、P2、P3、P4、P5,其序列分别如下: P1:5’-AGCTGACTTTCCATTGGCCGC-3’P2:5’-GGTTCTTCCTCAACACTGCA-3’P3:5’-CACGTTTCCAAGGTTCTTCC-3’P4:5’-TTGGCTGAGAATCGGGTCATT-3’P5:5’-ATTGGCTGAGAATCGGGTC-3’2 GLT-1a AS-ODNs的效果评价2005年Rothstein等研究表明,头孢曲松钠(Ceftriaxone,Cef)可以上调大鼠海马组织GLT-1 mRNA及其蛋白的表达。为高效筛选有效的GLT-1a AS-ODNs,本部分首先通过观察GLT-1a AS-ODNs对腹腔给予Cef引起的GLT-1a和GLT-1b上调的抑制作用,对所设计的GLT-1a AS-ODNs抑制GLT-1a蛋白表达的效果进行评价。在此基础,进一步观察筛选出的AS-ODNs对正常大鼠及脑缺血预处理(cerebral ischemic preconditioning,CIP)大鼠GLT-1a的抑制效果。2.1 Cef上调大鼠海马CA1区GLT-1a蛋白的表达2005年Rothstein等研究表明,Cef可以上调大鼠海马组织GLT-1及GLT-1b的表达,但并未特别指出其对GLT-1a的上调作用。本实验首先观察Cef对GLT-1a的上调作用。方法:10只雄性Wistar大鼠(280-300 g),随机分为sham组(n=5)及Cef组(n=5)。Sham组大鼠腹腔注射生理盐水(NS)(0.8 ml/kg),每日一次,共5次;而Cef组大鼠则以同样方法给予Cef(200 mg/kg)。以上各组均于末次腹腔注射后2 d取材,应用Western免疫印迹分析法检测大鼠海马CA1区GLT-1a的表达,以GLT-1a与β-actin免疫条带的积分光密度(integral optical density,IOD)比值表示GLT-1a的相对表达量,比值越大,表达越多。结果:Sham组大鼠海马CA1区可见GLT-1a的基础表达。与sham组相比,Cef组GLT-1a的表达明显增强(P<0.05)。以上结果表明,腹腔注射Cef可以上调大鼠海马CA1区GLT-1a的表达。2.2 GLT-1a AS-ODNs P1~P5各链对Cef诱导的大鼠海马CA1区GLT-1a蛋白表达上调的影响方法:30只雄性Wistar大鼠(280-300 g),右侧脑室置管、建立侧脑室给药通道、恢复5天后,随机分为sham组(n=5)和AS-ODNs组(n=5)。Sham组大鼠腹腔注射Cef(200 mg/kg),每日一次,共5次;于第一次注射Cef后36 h、72 h以及108 h右侧脑室注射双蒸水(DW)(GLT-1a AS-ODNs的溶剂)10μl。AS-ODNs组进一步分为P1-P5五个亚组,分别给予相对应的GLT-1a AS-ODNs双蒸水溶液10μl,内含GLT-1a AS-ODNs 18 nmol,给予方法与sham组双蒸水的给予方法相同。其它处理同sham组。以上各组均于末次腹腔注射后2 d取材,应用Western免疫印迹分析法检测大鼠海马CA1区GLT-1a的表达。结果:Sham组大鼠海马CA1区可见较强的GLT-1a表达。与sham组相比,AS-ODNs(P2)组GLT-1a的表达明显降低(P<0.05),而其它各组GLT-1a的表达均无明显变化(P>0.05)。以上结果表明,所设计的GLT-1a的5条AS-ODNs(P1~P5)中,P2能够有效抑制大鼠海马CA1区GLT-1a蛋白的表达。2.3 GLT-1a AS-ODNs(P2链,以下相同)抑制大鼠海马CA1区GLT-1a蛋白表达的特异性评价方法:对比观察GLT-1a AS-ODNs对GLT-1a和GLT-1b的抑制作用,确定其特异性。10只雄性Wistar大鼠(280-300 g),右侧脑室置管、建立侧脑室给药通道、恢复5天后,随机分为sham组(n=5)和AS-ODNs组(n=5)。Sham组大鼠腹腔注射Cef(200 mg/kg),每日一次,共6次;于每次注射Cef后即刻侧脑室注射DW(GLT-1a AS-ODNs的溶剂)10μl,每日一次,共6次。AS-ODNs组则于每次腹腔注射Cef后即刻侧脑室注射GLT-1a AS-ODNs的双蒸水溶液10μl,含GLT-1a AS-ODNs 15 nmol,每日一次,共6次。其它处理同sham组。以上各组均于末次腹腔注射后2 d取海马CA1区,应用Western免疫印迹分析法检测大鼠海马CA1区GLT-1a和GLT-1b的表达。结果:Sham组大鼠海马CA1区可见较强的GLT-1a表达和一定程度的GLT-1b的表达。与sham组相比,AS-ODNs组GLT-1a蛋白表达明显下降(P<0.05),而GLT-1b的蛋白表达无明显变化(P>0.05)。以上结果表明,GLT-1a AS-ODNs可特异性地抑制大鼠海马CA1区GLT-1a的表达。2.4 GLT-1a AS-ODNs抑制正常大鼠海马CA1区GLT-1a蛋白的表达方法:10只雄性Wistar大鼠(280-300 g),右侧脑室置管、建立侧脑室给药通道、恢复5天后,随机分为sham组(n=5)和AS-ODNs组(n=5)。Sham组大鼠侧脑室注射DW 10μl,每日一次,共6次;AS-ODNs组则以同样方法侧脑室注射GLT-1a AS-ODNs的双蒸水溶液10μl,含GLT-1a AS-ODNs 15 nmol。以上各组均于末次注射后2 d取海马CA1区,应用Western免疫印迹分析法检测大鼠海马CA1区GLT-1a的表达。结果:Sham组大鼠海马CA1区可见GLT-1a的基础表达。与sham组相比,AS-ODNs组GLT-1a蛋白表达明显下降(P<0.05)。以上结果表明,GLT-1a AS-ODNs可抑制正常大鼠海马CA1区GLT-1a的基础表达。2.5 GLT-1a AS-ODNs抑制CIP引起的大鼠海马CA1区GLT-1a蛋白表达的上调方法:30只正常雄性Wistar大鼠(280-300 g),右侧脑室置管、建立侧脑室给药通道、恢复5天后,随机分为以下各组(n=5):(1) Sham组:首先暴露双侧椎动脉,48h后暴露双侧颈总动脉,但不阻断上述动脉内的血流。(2)椎动脉凝闭组:首先凝闭双侧椎动脉、永久阻断其血流,48 h后暴露双侧颈总动脉,但不阻断血流。(3) CIP组:首先凝闭双侧椎动脉、永久阻断其血流,48 h后夹闭双侧颈总动脉、阻断血流3 min,之后恢复再灌流。(4) CIP+AS-ODNs组:首先凝闭双侧椎动脉,10 min后侧脑室注射AS-ODNs 15μl(25 nmol),以后每间隔24 h注射一次,连续注射4次,其余处理同CIP组。同时,设GLT-1a的Sense ODNs和Missense ODNs对照组,分别侧脑室注射GLT-1a的Sense ODNs或Missense ODNs溶液。以上各组均于末次手术后2 d取海马CA1区,应用Western免疫印迹分析法检测大鼠海马CA1区GLT-1a的表达。结果:Sham组可见大鼠海马CA1区GLT-1a的基础表达。与sham组相比,凝闭椎动脉后GLT-1a的表达出现一定程度的上调,CIP后则使其表达进一步上调(P<0.05)。侧脑室注射GLT-1a AS-ODNs可抑制CIP引起的GLT-1a蛋白表达上调及GLT-1a的基础表达,表现为CIP+AS-ODNs组的GLT-1a蛋白表达与CIP组及sham组相比明显下调(P<0.05),而侧脑室注射GLT-1a Sense ODNs和Missense ODNs溶液则对CIP诱导的GLT-1a蛋白表达上调无明显影响,表现为Sense ODNs对照组和Missense ODNs对照组的GLT-1a蛋白表达与CIP组相比无明显变化(P>0.05)。以上结果表明,GLT-1a AS-ODNs可以有效地抑制CIP引起的GLT-1a蛋白表达的上调。结论:所设计的5条GLT1 AS-ODNs(P1-P5)中,P2链可以特异性的抑制GLT-1a蛋白的表达。GLT-1a AS-ODNs(P2)既能抑制正常大鼠海马CA1区GLT1a的基础表达,又能抑制Cef及CIP诱导的GLT-1a的表达上调。