1研究背景河南林州市（原林县）及其比邻的辉县、安阳等地区是我国，也是世界上食管癌（EC）发病率和死亡率最高的地区，目前仍是引起该地区肿瘤相关死亡的主要原因。尽管已发现许多食管癌变相关分子改变，但是目前EC发生发展的分子机制仍不十分清楚，而且缺乏用于高危人群食管癌预警和早期诊断的敏感而特异的分子标志物。近年研究提示，上皮细胞多阶段癌变演进过程中，常异常表达胚胎发育过程中出现的蛋白，这些蛋白在成熟分化的组织中极少表达，利用这些异常蛋白作为肿瘤分子标志物，已被应用到临床肿瘤的早期诊断（如甲胎蛋白，等）。胎儿食管上皮发育是一种由幼稚单层柱状上皮逐渐发育成熟为复层鳞状上皮，由分化不成熟逐渐成熟，其上皮细胞由分裂增殖活跃的幼稚细胞逐渐趋于成熟分化和分区（底层干细胞，中层增殖、储备细胞，表层成熟、脱落细胞），这一发育过程与成人食管上皮癌变多阶段演进过程正相反，后者是由成熟分化的上皮组织在致癌因素作用下，出现过度增生和分化异常（失分化）最终发展为癌。很显然，比较胎儿食管上皮成熟分化和成人食管上皮失分化癌变二个完全相反过程中的上皮细胞形态和分子变化特征及其与细胞增殖和分化的关系，将为进一步阐明食管癌变的分子机制，筛选和建立用于高危人群预警和早期发现的分子标志物等提供重要的理论基础和手段。但是，目前有关不同胎龄食管上皮分子变化与成人食管上皮癌变过程中的分子改变的比较研究国内外尚未见报道。本研究室及其它研究室近年的研究提示，肿瘤抑制基因p53-Rb系统改变是河南食管癌高发区居民食管癌和癌前病变组织变化频率最高的分子改变，正常，癌前病变和癌患者血清蛋白质组分析提示其蛋白质谱存在明显差异显著蛋白。本研究正是在上述研究的基础上，利用蛋白质组学、免疫印迹、RT-PCR、免疫组化以及电镜超微结构和组织病理学等技术，对比分析来自河南食管癌高发区3-10个月不同胎龄食管上皮成熟分化和成人食管上皮癌变多阶段演进失分化过程中的分子变化差异及其与细胞增生和分化的关系，旨在筛选和建立增生和分化异常的分子标志物，加深对食管癌变机理的了解，为确定高危人群预警和早期发现的分子标志物提供重要的理论依据。2材料与方法2．1研究对象2．1．1胎儿食管172例（男性61例，女性109例，2例无性别）人胎儿食管组织标本均来自河南省辉县计划生育服务中心，其中胎龄3个月31例（18％）、4个月54例（31％）、5个月29例（17％）、6个月24例（14％）、7个月15例（8％）、8个月13例（8％）、9个月4例（2％）、10个月1例（1％）。2．1．2成人食管17例成人食管上皮标本来自河南省林州市中心医院和姚村食管癌医院，所有患者在术前均未接受任何的化疗或放疗。17例食管癌患者包括男性10例，女性7例，其平均年龄为60±7。2．2标本的收集与处理2．2．1胎儿食管胎儿食管标本收集和处理：胎儿食管标本取自合法流产及米索针剂（前列腺素类）引产正常胎儿，根据孕妇提供末次月经时间结合测量胎儿顶跟长度及手、足形态核实胎龄。胎儿引出后2个小时内，解剖出整个食管和胃上1／3部，沿食管纵轴将食管全层1／2切开，一半经85％酒精固定，剩余的一半入液氮中保存，后转入-80℃冰箱保存用于DNA、RNA的提取。2．2．2成人食管食管癌手术切除标本离体后，均在2小时内沿纵轴剖开。根据卢戈氏液对食管上皮增生活跃组织着色浅或不着色的原理，每例手术标本的一半先经卢戈氏液染色后对染区和不染区食管粘膜分别取材，尽量于肿瘤实体5cm之外或手术切缘，以后的处理及另一半标本的处理方法同2．2．1。2．2．3电镜胎儿食管粘膜面上、中、下段各取1mm³组织，2.5％中性戊二醛溶液固定。投射电镜标本制作：1％锇酸后固定，丙酮梯度脱水，Epon812树脂包埋，用醋酸铀及枸橼酸铅双染色；扫描电镜标本制作：新鲜组织2.5％中性戊二醛溶液固定，1％锇酸后固定，酒精梯度脱水，临界点干燥，离子镀金膜。2．3组织病理学诊断标准胎儿食管上皮分析：取组织结构清晰，染色均匀的HE切片，光镜下记录上皮的厚度，细胞层数、凋亡细胞数等。成人食管上皮分析：采用本实验室已建立的诊断标准，根据细胞形态、组织结构和分化程度，将成人食管上皮分为正常上皮（Normal，NOR）、基底细胞增生（Basic cell hyperplasia，BCH）、不典型增生（Dysplasia，DYS）、原位癌（Carcinoma in situ，CIS）、高分化鳞癌（squamous cell carcinoma，SCC）、中分化SCC和低分化SCC。2．4胎儿食管上皮的形态学分析2．4．1光镜图像分析应用显微测量器对酒精固定，HE染色的食管上皮进行计量并列表统计。2．4．2电镜日本电子公司生产JEM1230型透射电镜和美国安瑞公司生产AMRAY-1000B型扫描电镜观察。2．5免疫组织化学免疫组化采用卵白素-生物素-辣根过氧化氢酶复合物（Avidin Biotin Complex，ABC）法。2．6 RNA的抽提及逆转录PCR（RT-PCR）新鲜组织中总RNA的抽提采用试剂TRIzol（GibocoBRL，Life technologies，USA），测定总RNA的A260／A280比值来进行总RNA完整性及纯度的鉴定与评价，本实验中样品RNA的A260／A280值均在1.6-1.8之间。反转录过程采用Invitrogen公司的SuperScript^TM First-Strand Synthesis System for RT-PCR（Invitrogen，USA）反转录试剂盒，反应总体积为25ul，其中含有3ug的RNA，0.5mM的dNTPs，0.025ug／ul的oligo dT，5uM的MgCl2，0.01M的DTT，2U／uL的RNaseOUT TM抑制剂和2.5U／uL的SSII RT。PCR反应体系为30ul，内含1.5mM MgCl2，0.1mM dNTPs，0.05 Taq DNApolymerase和DNP、p21、p14、p15、RASSF1引物。热循环包括94℃预变性10min，35个循环：94℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min，72℃终延伸10min。2．7蛋白质组学方法2．7．1组织蛋白的提取及浓度测定采用蛋白裂解液（7％mol／L尿素，2mol／L硫脲，4％Chaps，65mmol／L DTT，0.1g／LPMSF，0.001g／L Aprotinin，0.05g／L RNase和0.2g／LDNase）提取新鲜组织中的蛋白质，其比例为1mg组织：2ul的样品裂解液。在冰上用组织匀浆器将组织匀浆5到10分钟，将匀浆液在冰浴下超声粉碎（400W，工作时间1S间歇2S，100个轮回），4℃15，000g离心15分钟，将上清液转入一新的Eppendorf管，弃去沉淀中所含有的组织和细胞残渣及碎片。4℃15，000g离心20分钟将上清液转入另一新的Eppendorf管，上清液即是提取到的蛋白提取物，将其分装后放入-80℃保存备用。蛋白浓度的测定采用Bradford法。2．7．2二维电泳（2-DE）、图像分析、MALDI-TOF质谱分析和蛋白质鉴定等电聚焦（immobilized．pH gradient，IPG）采用美国Bio-Brad公司的固相线性等电聚焦仪，第二项电泳采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，经硝酸银染色处理得到蛋白质的2-DE胶板。银染后的蛋白胶板经ImageScancer GS-800（Bio-Brad）扫描入计算机后得到2-DE图谱，采用专业的图像分析软件（PD-Quest 7．1．1，Bio-Brad公司）ImageMaster 2-D Elite分析2-DE图谱。对差异的蛋白质点，采用蛋白质点切割、胶内胰蛋白酶消化、MALDI-TOF质谱分析得到特异的肽质指纹图谱（peptide mass fingerprint，PMF），利用PMF和蛋白质数据库检索进行蛋白鉴定。2．8免疫印迹（Immunoblotting）利用PMF和蛋白质库进行了蛋白质点鉴定之后，对于Dermatopontinprotein（DNP，皮肤桥蛋白）又进行了一维和二维免疫印迹的验证。一维或二维电泳之后，采用Semidry电转移槽将胶上的蛋白质转移至硝酸纤维素膜上（0.8mA／cm²）。电转移之后，将硝酸纤维素膜先用5ml的5％脱脂奶粉进行封闭非特异性的结合反应，然后分别与一抗DNP（1∶300）4℃冰箱过夜孵育。特异结合的条带或斑点的检测采用DAB显色法（DAB kit，中杉金桥公司）2．9统计分析采用SPSS10.0统计软件，进行χ²检验和Kappa检验，经ImageMaster 2-D Elite分析得到蛋白质点的标准化体积及差异，运用单项的Student’s t检验，检验的水准为0.05。3结果3．1组织病理学观察：胎儿食管：光镜下观察190例不同胎龄（3～10个月）胎儿食管上皮组织发现，3月份胎儿食管上皮薄厚不均（2～5层细胞），上皮类型为复层扁平上皮但各层细胞无明显形态分化差异。均似扁平低分化细胞外形。4～6月上皮细胞层数5～8层，细胞分裂增殖最旺盛，基底细胞层部分区域可厚达3层，细胞排列不整齐，基底细胞呈柱状、立方状、胞浆呈强嗜碱性、核大染色深染色质颗粒粗。可见散在分布凋亡细胞。5～10月上皮细胞层数6～10层，基底细胞层1～2层，细胞排列整齐，上皮层内极仍可见到凋亡细胞，其中一例6月份胎儿观察到鳞状上皮内间杂有柱状上皮类似成人Barret’s食管外观。7个月胎儿食管上皮内见到食管腺导管。成人食管：取经病理学证实17例带有癌旁组织的食管癌，根据卢戈氏液染色结果，其取一块组织，被分成组1和组2。组1包含了15例ESCC和相应配对的癌旁正常食管粘膜上皮组织；又根据分化程度的不同将ESCC分为高、中、低分化三组。组2包括了2例ESCC及相应的癌前病变，病例23含有1个DYS、1个CIS和ESCC；病例29含有1个BCH、1个DYS和ESCC。3．2胎儿食管上皮超微结构电镜下胎儿食管上皮细胞胞浆内细胞器少，有丰富的游离核糖体及糖原，由基底层到表层细胞胞质内张力丝渐渐增多。缝隙连接随胎龄增加自基底细胞层到表层细胞逐渐减增多，而桥粒连接则相反。3．3免疫组织化学分析PCAN、p16、CK13、CK7免疫染色阳性评分的结果表明：胎儿食管上皮3月胎龄阳性表达率和单位面积阳性细胞数最少，随胎龄增加阳性表达率和免疫阳性细胞数逐渐增多，与5、6、7、8、9月份比较有显著差异。令人感兴趣是：p16、CK13、CK7在成人食管癌旁正常食管粘膜上皮中有阳性细胞表达，依次从BCH→DYS→CIS→高分化SCC→中分化SC C→低分化SCC其免疫染色阳性细胞数呈降低趋势，PCAN在成人食管癌旁正常食管粘膜上皮细胞中有低水平表达，依次从BCH→DYS→CIS→高分化SCC→中分化SC C→低分化SCC其免疫染色阳性细胞数呈升高趋势，胎儿食管上皮发育过程与食管上皮癌变过程中p16、CK13、CK7蛋白表达呈相反变化趋势，而PCAN表达变化则呈一致性升高趋势。本研究中RASSF1、p21、p14、p15在各胎龄食管上皮免疫染色呈完全阴性表达；3．4 RT-PCR胎儿食管上皮PCAN RT-PCR结果进行半定量分析表明随胎龄增加mRNA表达呈升高趋势，与癌旁正常组织、癌前病变、癌组织间表达变化趋势存在着明显一致性。p16mRNA在胎儿食管上皮呈升高趋势而在癌旁正常组织、癌前病变、癌组织间表达变化呈降低，p15、p14、p21 mRNA在癌旁正常组织、癌前病变、癌组织差异表达，而在各胎龄胎儿食管上皮阴性表达。3．5蛋白组学分析2-DE蛋白图谱的分析结果表明共有26个具有统计学意义的差异表达蛋白质点，对这些点进行了MALDI-TOF质谱分析，得到了PMF图谱。然后利用PMF和蛋白质数据库检索，共鉴定出21种差异表达的蛋白，有些蛋白含有不同的异构体，如丙糖磷酸异构体Ⅰ（triosephosphate isomerseⅠ）、甲状腺激素配相互作用分子异构体B(thyroid hormone receptor interactor 11，isoform CRA_b等。在21种差异表达的蛋白中，其中11种蛋白的表达在癌组织及胎儿食管上皮中升高，而在正常食管上皮组织中下降和缺失，包括Chain A，crystal structure of A recombinant glutathione transferase（重组谷光甘肽转移酶晶体结构A链）；Dermatopontin（皮肤桥蛋白，DPN）；Heat shock protein 27（热休克蛋白27）；Calcium-binding protein S100A9（钙结合蛋白S100A9）；Immunoglobulin heavy chain variable region（免疫球蛋白重链可变区）；HCG1997574（人绒毛膜促性腺激素，HCG）；Phosphoglycerate mutase 1（磷酸甘油酸变位酶Ⅰ）；peroxiredoxin 6（过氧化物酶6）；Chain A，Human triosephosphate isomerase of new crystal form（人丙糖磷酸异构酶A链）；Actin，alpha，Cardiac muscle isoform（心肌a肌动蛋白异构体）；Disabled homolog 1。在正常食管上皮不表达的蛋白DPN、S100calcium-binding protein A9（钙结合蛋白S100-A9，CaBPs100A9）、Heat shock protein 27（热休克蛋白-27，HSP-27）、peroxiredoxin 6（过氧化物酶6），在胎儿食管上皮及食管癌组织中均呈高表达，提示这四种蛋白与细胞增殖有明显相关，执行幼稚上皮组织的某些功能，可能与细胞的分化有关。3．6免疫印迹DPN蛋白的1-D和2-D免疫印迹的结果不但验证了蛋白质组学所鉴定出的蛋白，同时对其1-D免疫印迹条带量化分析结果也表明了该蛋白在正常组织中的表达降低；而在癌前病变及食管癌组织中明显升高。4结论4．1本研究中发现的胎儿食管基底细胞层旺盛的增殖状态、凋亡细胞，鳞状上皮中间杂柱状上皮岛与成人食管上皮不典型增生、食管癌组织中凋亡细胞出现及Barret’s食管现象比较，提示成人食管上皮癌变过程中个别阶段与胎儿食管上皮成熟发育过程有极相似的形态变化特征。应用电镜技术观察胎儿食管上皮的超微结构并与以往食管癌、癌前病变、癌旁正常食管上皮超微结构的研究比较，发现胎儿食管上皮早、中期亚细胞结构和细胞间连接与食管癌及癌前病变组织具有一定的形态相似性，可能与该两类组织同多数细胞属低分化分裂增殖旺盛幼稚上皮组织有关。4．2 PCNA、p16、CK7、CK13在胎儿食管上皮中表达随胎龄增加呈升高趋势呈提示：p16、CK7、CK13在食管癌、癌前病变组织中表达呈降低趋势，PCNA在两种组织中表达呈一致动态变化特征。PCNA、p16、CK7、CK13参与了胎儿食管上皮成熟分化过程并且在成人食管上皮失分化癌变过程中也起到不可忽略的促进作用。P14、p15、p21在胎儿食管上皮阴性表达，提示其可能不参与胎儿食管上皮的成熟分化，但在食管癌、癌前病变组织中的高表达，说明胎儿食管上皮成熟分化与成人食管上皮失分化虽在某阶段其分子机制有一定的相似性但并不完全一致。4．3本研究应用以2-DE为基础的蛋白质组学技术，同时结合MALDI-TOF质谱分析和蛋白质组生物信息学技术，对来自河南食管癌高发区林州市的食管癌、不同胎龄正常胎儿食管上皮及癌旁正常食管粘膜上皮组织进行了比较研究，发现了二十一种与食管癌发生发展相关的蛋白，这些蛋白与细胞组织结构的维系、能量代谢、蛋白的合成、细胞的生长、分化、凋亡及粘附和迁移等过程有关；4．4本研究所发现的多个食管癌相关蛋白，一方面增进了对食管癌发生的分子机制的理解与认识，食管癌的发生与发展是一个多因素诱发、多基因参与、多阶段演进的漫长的过程；另一方面也可能为解决长期困扰我们的问题—高危人群筛查与食管癌早期的诊断，提供了更多的候选分子或指标；并为临床治疗靶点的选择提供了重要的线索；4．5 DPN蛋白在胎儿食管上皮、食管癌及癌前病中表达变动态变化特征提示：DPN是食管癌前病变中重要的分子变化之一，其表达的增强或降低可能与癌前病变的进展、逆转有关，有可能成为高危人群筛查及食管癌早期诊断的分子指标；