论文部分内容阅读
神农香菊(Chrysanthemum indicum var.aroma)ticum是菊科(Compositae)菊属(Chrysanthemum)的多年生草本植物,植株香气浓郁,分泌物主要化学成分为龙脑、α-侧柏酮、β-侧柏酮等萜类化合物,是一种珍贵的香料植物。DXR基因是萜类物质合成MEP途径的一个关键的限速酶,对下游MEP的合成具有重要影响。为探究并完善神农香菊萜类物质合成通路关键酶基因的表达方式,本研究以神农香菊为实验材料,预测并分析了其萜类物质合成通路的关键酶基因,克隆并分析了神农香菊萜类合酶(CiDXR)基因及其启动子。研究结果如下:在经过茉莉酸甲酯处理后的神农香菊转录组数据中,共筛选到21个上调表达的萜类物质合成通路基因,未发现下调表达的基因。GO生物学过程注释到的主要集中在氧化还原过程、代谢过程、裂解酶、解旋酶和萜烯合酶活性生物过程中。在经过UV-B紫外光处理后的神农香菊转录组中,共发现68个差异表达基因,上调表达的片段共有36个,下调表达的基因片段有32个。GO生物过程注释主要集中在氧化还原过程、代谢过程和催化活性中。有6个基因被注释到萜类合酶活性过程。从神农香菊叶片中克隆到目的基因,该基因序列开放阅读框(ORF)长度为1419bp,编码472个氨基酸,其序列中具有2个DXR功能域:LPADSEHSAI和NKGLEVIEAHY,将该基因命名为CiDXR。蛋白结构预测CiDXR编码的蛋白序列结构域中嵌入了 NADPH结合的典型保守域。荧光定量分析CiDXR基因的表达情况,发现其在叶片中表达最显著,茎和根中表达量依次降低。由0.5%的茉莉酸甲酯处理4h、8h、24h和48h后,CiDZXR基因的相对表达量随着处理时间增加,呈现先增高后降低的趋势,处理24h时表达量最高。根据CiDXR基因序列克隆获得启动子,序列长度为833bp,含有多种顺式作用元件,有18个启动子核心元件TATA-box,10个启动子和增强子共同的核心元件CAAT-box,光信号响应相关元件ACE、G-box、TCCC-motif、TCT-motif共5个,茉莉酸甲酯响应调控元件CGTCA-motif、TGACG-motif共两个、脱落酸响应元件ABRE两个、逆境响应元件MYB、MYC共3个以及2个玉米醇溶蛋白代谢调控元件O2-site,还有17个未知功能的作用元件。将CiDXR基因启动子及5’缺失片段与含有GUS报告基因的质粒重组,构建瞬时表达载体,农杆菌介导法转化烟草,通过荧光定量实验验证发现3个启动子片段均具有启动活性。