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利用Tn5插入突变,我们构建了大肠杆菌(Escherichia coli)AB1157的突变文库并从中筛选到了yihE基因的插入突变株。在不影响药物与DNA拓扑异构酶与DNA形成复合物的情况下,此突变株对喹诺酮药物具有超敏感性。在低到中等药物浓度时候,突变株都极容易被药物杀灭。
把插入突变转导入大肠杆菌另一背景菌株DM4100后,菌株对药物仍然具有超敏感表型,而对in-frame yihE突变株分析也表明了yihE突变直接导致了细菌对药物具有超敏感性。
用含有野生型yihE基因的质粒pBR322转化yihE突变株进行互补实验表明质粒上的yihE基因不仅互补了突变株的超敏感性,而且在两株细菌中质粒上yihE的过量表达都在喹诺酮处理下对细菌起到了保护性的作用。
尽管氯霉素在喹诺酮类原型药物(萘定酸)杀菌中对细菌细胞具有完全的保护作用,但是它只是对突变株起了部分的保护作用,表明YihE的保护作用应该与喹诺酮类原型药物杀菌的氯霉素敏感途径有关。
在不同条件下,我们测定了yihE突变株对氟化喹诺酮类药物ciprofloxacin的敏感性。结果显示,在氯霉素存在条件下突变株较野生型菌株细胞存活率仍然较低,表明YihE的保护作用与氯霉素不敏感途径有关。
对不同生长状态下突变株对药物的敏感性检测结果表明,在稳定期存在的其他一些特殊因子在喹诺酮类药物杀菌过程中对细胞也起到保护性作用。
药物对编码.yihE基因调控因子的cpxA突变株的杀菌活性测定表明,cpxA突变株也表现出了对药物的超敏感性,而相对于野生型菌株,cpxR和cpxP突变株都对药物表现出一定的耐受性。对cpxA突变株做进一步分析表明,cpx双组分信号调控系统在喹诺酮类药物杀菌过程中对细菌也起到保护性作用。
采用RT-PCR对野生型和突变株中.yihE基因在不同的条件下的转录表达测定表明,在不同的萘定酸浓度处理下,yihE基因的表达有很大的差异。而且,在对数中期和稳定期yihE基因的表达也有很大的不同。此外我们还对cpxRA突变株中yihE基因的转录表达进行了分析。对不同突变株的药物杀菌活性分析和yihE基因的转录表达分析表明,YihE所提供的保护作用与喹诺酮类药物杀菌的两条途径(氯霉素敏感和氯霉素不敏感途径)都有关。而且,药物处理后,细菌细胞的存活率与yihE基因的表达有一定相关关系。