糖胺聚糖是一大类由糖胺或含糖胺的二糖作为基本重复单元组成的线性多糖,包括肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、透明质酸、硫酸角质素、甲壳素及甲壳胺等。肝素及硫酸乙酰肝素由不同程度及位点的O-磺酸、N-乙酰/磺酸修饰的氨基葡萄糖和糖醛酸二糖组成。硫酸软骨素及硫酸皮肤素则由O-磺酸修饰的N-乙酰氨基半乳糖和糖醛酸组成。透明质酸的二糖重复单元是没有磺酸修饰的N-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸。硫酸角质素不含糖醛酸,主要由磺酸修饰的半乳糖和氨基葡萄糖二糖组成。年产量达亿吨的甲壳素是由N-乙酰氨基葡萄糖组成的多聚糖,其脱乙酰产物甲壳胺因为具有良好的理化性质而倍受关注。从动物组织提取的肝素是临床上已使用了近80年的的抗凝血药物,也是世界上产量和销售额最大的糖类药物。近年来肝素类药物的销售量以每年20%的速度递增,2009年全球肝素类药物的销售额已达69亿美金。从动物组织或软骨提取的硫酸软骨素广泛被关节炎病人服用。在美国的非处方药物中,硫酸软骨素的销售额位居第二。中国也是硫酸软骨素的主要出口大国,但除了硫酸软骨素A作为药用外,其它结构硫酸软骨素仍没有进入药典。透明质酸不仅因其保湿性用于美容,还具有很好的组织相容性而在眼科显微手术、药物释放及组织工程领域广泛应用。近20年研究发现,甲壳胺以及甲壳胺衍生物具有一些如抗菌,免疫刺激,降血脂,甚至有抗癌作用,目前在世界范围内有37项甲壳胺作为药物的临床研究。糖胺聚糖类药物和其它药物的不同在于其靶点大多存在于细胞之外,不仅参与血液循环系统、神经系统及免疫系统调节,而且参与细胞的粘附、识别以及信号的转导等,其安全性高、毒性低以及特异性强的特性使其成为本世纪药物开发的热点。然而,由生物合成的糖胺聚糖结构、分子量及磺化度多变难控,作为药物其质量控制是一个长期解决不了的问题,因此严重阻碍了糖胺聚糖类药物的研究与开发。表征动物来源糖胺聚糖结构的主要手段是酶降解产生二糖,然后使用各种分析手段对酶降解产生的二糖进行与二糖标准品的对比分析。这些方法的科学性建立在裂解酶可以完全将糖胺聚糖降解为二糖,不存在不能被酶降解的片段。但是生物酶产品质量控制,保存不当都会导致活性差异,进而无法保证糖链被全部降解成为可供分析的二糖,每次操作的差异性不可避免。更重要的是糖胺聚糖结构复杂,几乎所有糖胺聚糖都存在不能被酶降解成为二糖的片段。本论文针对所有糖胺聚糖都含有氨基糖为基本出发点,开发了一种可以用于结构解析和质量控制的糖胺聚糖化学降解分析方法,这样就可以摆脱酶解分析二糖中的一系列不可控因素。我们经过实验选择使用亚硝酸降解动物糖胺聚糖和甲壳胺。亚硝酸可以通过和糖链中的氨基糖,形成重氮盐,重氮盐的在水溶液环境不稳定,容易形成稳定程度更高的N2离去,重氮盐碳原子缺电子受到糖环上C5位成环的O攻击,可以形成新的五元糖环,随之的是电子转移到糖环的C1,导致糖苷键断裂并形成新还原糖。亚硝酸降解产物可以和常用于糖类衍生的试剂1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)以1：2的比例反应脱水形成具有强紫外吸收的糖-2PMP复合物,该复合物具有利于分离和检测的特征,后续可以使用高效液相分离检测不同的糖-2PMP衍生物。糖胺聚糖可含葡萄糖胺(GlcN)或半乳糖胺(GalN,亚硝酸降解的产物分别是2,5脱水甘露糖(M)和2,5-脱水塔罗糖(T)。我们以葡萄糖胺的亚硝酸降解产物2,5脱水甘露糖为研究对象,优化了亚硝酸降解产生M及最佳PMP衍生条件,从而进一步开发了糖胺聚糖、甲壳胺及衍生物的降解衍生方法。亚硝酸降解的糖胺聚糖产物经过HPLC分离电喷雾电离质谱检测,通过一些已知结构的化学合成糖胺聚糖类似物如肝素五糖的亚硝酸降解产物,或是特殊脱硫产物来确定肝素/硫酸乙酰肝素的亚硝酸降解产物结构。还使用二级质谱来分析亚硝酸降解产物结构,通过碎片离子判断硫酸酯位于二糖中的糖胺还是糖醛酸,结合能水解糖醛酸的酶来消去部分亚硝酸降解二糖来确定其结构,通过这一系列确认结构手段的联合使用,阐述了肝素类糖胺聚糖的亚硝酸降解产物的所有结构。运用亚硝酸降解分析市场上常见的低分子肝素(依诺肝素,那曲肝素,达纳肝素),分析由不同制备方法生产的低分子肝素结构上的差异,测试该方法的检测灵敏度,检测线性范围等等。对比传统肝素类结构解析和质量控制方法,使用肝素酶Ⅰ Ⅱ Ⅲ来降解肝素和低分子肝素并用传统方法来分析我们实验中所用的肝素/低分子肝素,验证新开发用于肝素类结构解析,质量控制方法的准确性,比较两种方法的优劣。分析硫酸软骨素类糖胺聚糖,硫酸角质素,硫酸乙酰肝素,必须先经过脱乙酰处理得到能和亚硝酸反应的自由氨基,本文还对含有大量乙酰的糖胺聚糖进行脱乙酰反应优化得到全脱乙酰糖胺聚糖进行亚硝酸降解得到全部结构信息。甲壳胺和甲壳素的差异在于糖链中的乙酰取代程度,乙酰度是甲壳胺质量控制唯一参数。我们使用亚硝酸降解甲壳胺,其专一作用于无取代的氨基糖,不影响N-乙酰氨基葡萄糖。形成2,5脱水甘露糖,或是N-乙酰氨基葡萄糖-2,5脱水甘露糖寡糖,通过亚硝酸降解PMP衍生HPLC-UV分析,可以测算出乙酰度。使用传统的乙酰测定方法如滴定/1H-NMR验证得到一致结果。这一分析甲壳胺的方法还可以用于测定甲壳胺中的N-乙酰氨基葡萄糖的分布,及聚合度,我们使用化学乙酰方法合成较高乙酰度的甲壳胺,经过我们新开发的亚硝酸降解PMP衍生方法分析结果显示其乙酰度上升寡糖聚合度可高达11,可见我们的甲壳胺分析方法可以作为甲壳胺质量控制的指纹图谱。合成甲壳胺的衍生物磺化甲壳胺,并使用亚硝酸降解PMP衍生HPLC分析,可以得到和13C-NMR一致的结构信息。基于PMP在分析糖胺聚糖和甲壳胺类多糖中的重要作用,我们合成了两种氘代PMP,以氘代乙酸为原料合成了1-苯基-3-甲基(D3)-5-吡唑啉酮D3PMP,以氘代苯胺为原料合成了1-苯基(D5)-3-甲基-5-吡唑啉酮D5PMP.将两种PMP同位素用于标记还原性糖,使用质谱鉴定三种同位素质量数差别,将PMP同位素用于质谱定量,联合亚硝酸降解分析不同厂家的低分子肝素差别,同位素标记对比分析猪组织心脏肾脏糖胺聚糖的差异。小结：本文开发一种化学降解,PMP柱前衍生HPLC分析解析糖胺聚糖结构及糖胺聚糖质量控制方法。使用本论文建立的脱乙酰、亚硝酸降解联合PMP柱前衍生方法分析糖胺聚糖二糖,摆脱了对价格较高的糖胺聚糖酶的依赖。此方法适用于各种糖胺聚糖的结构分析,不仅成本低,还具有同时分析糖胺聚糖混合物这一优点。对于来源广价格低的糖胺聚糖如甲壳胺类,在PMP衍生后的紫外检测器就可以达到结构分析要求。我们新建立的方法还可以使用3种质量数不同的PMP同时标记3种化学降解了的糖胺聚糖样品,用色谱质谱联用定性定量比较3种混合进样的糖胺聚糖结构上的相同与不同,从而为未来糖胺聚糖药物开发与质量控制提供了新方法及新思路。