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ADAMTS(A Disintegrin and Metalloproteinase with Thrombospondin motifs)是一种金属蛋白酶。ADAMTS家族作用底物为细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)。ADAMTS家族作用广泛,在胚胎发育、器官发生、炎症、肿瘤等多种生理病理过程发挥作用。ADAMTS18尚不知功能和底物,被称为“孤儿ADAMTS”。2009年,GWAS(Genome-wide association and follow-up replication study)研究首次报道ADAMTS18是一种新的骨密度候选基因,与人类骨密度及髋部骨折密切相关。我们实验室前期构建了Adamts18基因敲除(Knockout,KO)小鼠。与野生(Wildtype,WT)小鼠相比,Adamts18 KO小鼠出生后体重显著减轻、身长变短、骨密度降低。但ADAMTS18如何调控出生后骨骼生长及其在骨质疏松中的作用机制迄今仍不清楚,本论文将对上述科学问题展开研究。研究方法:(1)采用RNA原位杂交、q RT-PCR及RT-PCR方法检测Adamts18m RNA在不同发育期骨组织及骨细胞中的表达。(2)采用夹心ELISA方法检测8周龄WT小鼠和KO小鼠血清中生长激素(Growth hormone,GH)和胰岛素样生长因子1(Insulin-like growth factor 1,IGF-1)含量。(3)对4周龄WT和KO小鼠胫骨进行石蜡切片和番红O-固绿染色;采用q RT-PCR及Western Blot方法,检测小鼠软骨细胞中ColⅡ、ColⅩ、Bmp6、Bmp7、Runx2、Mmp13、Sox5、Sox6、Sox9、Fn1和Aggrecan表达。(4)检测15周龄WT和KO小鼠的股骨中碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活性、血清骨钙素(Osteocalcin,BGP)含量和抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)活性。(5)采用免疫组化及Western Blot方法检测15周龄WT和KO小鼠股骨中纤连蛋白(Fibronectin)、黏着斑激酶(Focal Adhesion Kinase,FAK)、破骨细胞分化因子(RANKL)的表达。(6)从3周龄WT和KO小鼠股骨中分离骨髓间充质干细胞(BMSCs),在体外进行诱导分化为成骨细胞,在第7天(d)、14 d、21 d进行ALP活性测定,在14 d、21 d进行Von Kossa矿化染色利用分离出的BMSCs体外诱导分化为破骨细胞,并进行TRAP染色和破骨细胞鉴定。研究结果:(1)Adamts18 m RNA主要表达在胚胎期(E14.5)小鼠软骨膜内层梭形骨祖细胞。在出生后及骨生长发育期,Adamts18 m RNA主要表达在2周龄小鼠骨生长板、4周龄小鼠骨髓和8周龄小鼠骨干中。Adamts18主要由发育软骨细胞和骨髓间充质干细胞分泌。(2)阿尔新蓝和茜素红双重染色结果显示,胚胎期WT和KO小鼠全身骨骼及胫骨、股骨软骨发育未见显著差异。(3)夹心ELISA结果显示,WT小鼠和KO小鼠血清中GH和IGF-1含量无显著差异。(4)番红O-固绿染色结果显示,KO雄性小鼠生长板较WT小鼠更短,肥大软骨细胞数目更少。(5)相比于WT小鼠,KO小鼠软骨细胞基质中Runx2和Mmp13的转录水平表达及蛋白水平表达均显著降低。ColⅡ、ColⅩ、Bmp6、Bmp7、Sox5、Sox6、Sox9、Fn1和Aggrecan在WT和KO小鼠软骨细胞中转录水平表达未见显著差异。(6)KO小鼠与WT小鼠相比股骨中的成骨细胞ALP活性和BGP水平无显著性差异;但KO小鼠骨小梁区域TRAP活性显著增强。(7)免疫组化及Western Blot结果显示,KO小鼠Fibronectin、磷酸化FAK及RANKL表达较WT小鼠显著升高。(8)KO小鼠与WT小鼠相比BMSCs体外成骨分化过程中ALP活性及体外成骨分化钙结节数均无显著性差异。(9)KO小鼠BMSCs体外破骨细胞分化数目明显多于WT小鼠,且破骨分化相关基因Siglec-15,Nfatc1,dc-stamp,ctsk的表达较WT小鼠显著升高。综上所述,1)ADAMTS18在软骨膜、生长板及骨髓间充质等部位表达。2)ADAMTS18缺失影响了软骨细胞的终末期分化。3)ADAMTS18缺失亦可导致Fibronectin在骨组织中沉积,成骨细胞内FAK的磷酸化增强,成骨细胞分泌的RANKL升高。4)ADAMTS18缺失导致破骨细胞分化相关基因表达升高,BMSCs向破骨细胞分化增强。本研究不仅有助于揭示软骨生长发育和骨质疏松的新机制,也可为临床侏儒症和骨质疏松等相关骨疾病的诊断、治疗提供新的分子靶点。