食管癌(Esophageal Carcinoma，EC)是全球范围内第六大恶性肿瘤，发病率与死亡率居高不下，据统计5年生存率不超过15％，并且随着时代的发展近些年来其发病率呈现出逐年上升的形式。在亚洲的各个国家中，尤其东亚地区，包括我国，所有食管恶性肿瘤疾病中最为常见的病理类型为食管鳞状细胞癌(Esophageal Squamous Cell Carcinoma，ESCC)，ESCC约占全部确诊病人数量的90％，具有恶性肿瘤的易复发和易转移等常见特点。尽管在如外科手术切除及内科放化疗技术这些恶性肿瘤早期诊断及早期治疗方面，取得了令人欣喜的极大进步，但食管鳞状细胞癌的总体治疗效果并不理想，常见的原因在于大部分患者在疾病进展到了中晚期，同时出现了无法耐受的症状后，才通过一系列检查发现恶性肿瘤的存在，往往丧失了有效的治疗方法，拉低了总体治疗效果，导致了较低的生存率，也对患者家庭和社会造成了重大的影响。因此，积极了解食管鳞状细胞癌的具体发生、发展机制，最大可能的寻找预防疾病发生、发展和早期治疗的有效途径与方法，大力加强对食管鳞状细胞癌病理机制的专项研究，是该疾病研究的重要难点和热点。　　MicroRNA(miRNA)是一类非编码单链小分子RNA，约17～25个核苷酸(nucleotide，nt)分子大小，在大自然界中的真核生物中miRNA广泛存在，同时也是一组短序列RNA，它不参加编码蛋白质。经研究发现，miRNA抑制靶mRNA的翻译的机制是通过连接靶基因的3-UTR(3untranslated region)区域完成的，甚至可以直接作用于靶mRNA，引起靶mRNA的降解，进而达到对多种生物细胞的病理生理过程进行调控的功能，其中不仅包括细胞侵袭，细胞分化、增殖，更涉及到血管生成及细胞凋亡等。随着研究的深入，越来越多的科学研究发现并通过实验证实人类多种疾病的发生、发展与miRNAs的异常改变有着巨大的关联。尤其是在恶性肿瘤的方面，研究发现恶性肿瘤的多个阶段都与miRNAs存在密切关系，miRNAs的改变对恶性肿瘤的发生、发展具有重要的影响。近年来，在食管鳞状细胞癌的研究中发现miRNAs，不仅仅一方面可作为癌基因而存在，促进癌细胞的形成、发展，同时在另一方面也可以起到抑癌基因的作用，发挥了抑癌功能。上述这些研究发现也提示：有可能通过早期干预miRNA来对食管鳞状细胞癌进行有效的诊断与早期的治疗。　　在本项研究中，首先通过miRNA芯片技术对ESCC组织中的miRNAs表达水平进行分析，其中miR-206引起我们的兴趣。miR-206在多种肿瘤中发挥抑癌基因功能，但是在ESCC中未见报道，因此选取miR-206进行进一步的细致研究。通过测定在ESCC组织及ESCC细胞系中miR-206的表达水平，分析miR-206的异常表达与ESCC临床特征的关系，如T分期、淋巴结是否转移、分化程度及TNM分期情况。通过细胞转染技术将miR-206在食管鳞状细胞癌细胞中的表达水平上调，观察miR-206对食管鳞状细胞癌细胞增殖及细胞凋亡产生的影响情况。通过生信分析的方法寻找miR-206可能的靶基因，研究与其调控的可能的相关信号通路，探讨miR-206在ESCC发病过程中的可能的作用机制，从而探寻出新的食管鳞细胞癌诊断和治疗的理论基础。本文主要分为以下几个部分:　　第一部分 miR-206在食管鳞状细胞癌细胞中的表达水平及临床意义　　目的:对ESCC组织中的miRNAs表达水平通过miRNA芯片技术进行分析，其中miR-206引起我们的兴趣。miR-206发挥抑癌基因功能在多种恶性肿瘤中已被发现，但是在ESCC中暂仍未见到有所报道，因此选取miR-206作为研究的方向，进行下一步的研究。测定在ESCC组织及ESCC细胞系中miR-206的表达水平，分析miR-206表达水平异常与ESCC的细胞分化程度、淋巴结转移及肿瘤TNM分期等临床特征之间的关系。　　方法：从2010年10月到2016年9月期间在郑州大学第二附属医院胸外科首次确诊为ESCC患者中，分别收集肿瘤组织及瘤旁正常组织标本。采用microRNA芯片技术分析ESCC组织中的miRNAs表达水平，实时荧光定量PCR方法用于测定在ESCC肿瘤组织及瘤旁正常组织中miR-206的表达水平，同时检测在多个ESCC细胞系中miR-206的表达情况。　　结果：1MicroRNA芯片结果显示：35个miRNAs显著上调，22个miRNAs显著下调。其中miR-206是下调最为显著的miRNAs之一。　　2在52例ESCC肿瘤组织中，miR-206的表达水平显著低于瘤旁正常组织。其在ESCC细胞系中的表达水平同样显著下调。　　3miR-206在组织中的表达水平与TNM分期及淋巴结转移密切相关。　　结论：在ESCC组织及ESCC细胞系中，miR-206的表达水平均出现显著下调，结果表明miR-206在ESCC的发生、发展过程中具有重要作用，作为一种抑癌基因发挥重要作用。　　第二部分 miR-206抑制ESCC细胞增殖，诱导细胞凋亡　　目的:观察miR-206表达水平的变化对ESCC细胞增殖及凋亡的影响，探讨miR-206的表达与ESCC生物学特性的关系。　　方法:选取miR-206表达水平最低的KYSE410和ECA109来进行获得功能实验。将miR-206 mimics转染到ECA109与KYSE410细胞中达到上调miR-206的表达水平的作用。通过CCK-8方法来对转染后的ESCC细胞的增殖能力进行评价，通过流式细胞术对转染后细胞凋亡的变化进行检测、评价。　　结果:1在ECA109与KYSE410细胞中，转染48h后，miR-206的表达水平明显提高。CCK-8结果显示miR-206的过表达明显抑制ESCC细胞的增殖;而转染48h后，两组的区别更加显著。　　2流式细胞术结果显示:过表达miR-206能够明显促进ESCC细胞的凋亡。　　结论:miR-206过表达能够抑制ESCC细胞增殖能力，促进ESCC细胞凋亡。　　第三部分 miR-206对食管鳞状细胞癌作用机制的初步研究　　目的:众所周知，miRNAs可以通过碱基互补配对的方式与mRNA的3-UTR区域结合，导致mRNA的降解或抑制其转录后翻译。通过运用生物信息学软件，我们预测到miR-206存在多个潜在靶基因，其中一个公认的促癌基因c-Met引起了我们的兴趣，我们选择c-Met来进行下一步的研究，探索c-Met是否为miR-206的直接靶基因来影响ESCC细胞的生物学特性。　　方法:双荧光素酶实验验证c-Met是否为miR-206的直接靶基因，检测转染前后ESCC细胞中c-Met蛋白表达的差异，同时通过功能实验进一步验证c-Met是否影响miR-206对ESCC细胞的增殖及凋亡作用。Western Blot检测miR-206的异常表达对AKT/mTOR信号通路的影响。　　结果:1双荧光素酶实验显示，miR-206 mimics明显抑制c-Met-3UTR-WT的荧光素酶活性，而敲低miR-206的表达促进c-Met-3UTR-WT的荧光素酶活性。过表达或者敲低miR-206的表达对c-Met-3UTR-Mut的荧光素酶活性没有影响。　　2转染miR-206 mimics后，ECA109与KYSE410细胞中c-Met蛋白的相对表达量要显著低于对照组。转染miR-206 inhibitor后，ECA109与KYSE410细胞中c-Met蛋白的相对表达量要显著高于对照组。　　3无3-UTR区域的pcDNA3.1-c-Met和miR-206 mimics共转染到ECA109与KYSE410细胞中。pcDNA3.1-c-Met能够反转miR-206 mimics对ECA109与KYSE410增殖能力的抑制作用，减弱miR-206 mimics对ECA109与KYSE410凋亡能力的促进作用。　　4过表达miR-206明显抑制Met、AKT与mTOR的磷酸化，表明miR-206抑制AKT/mTOR信号通路的激活。　　结论:在ESCC中，c-Met为miR-206的直接靶基因，miR-206通过抑制c-Met的表达发挥其抗肿瘤的作用。