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目的1．探讨体外进行骨髓间充质干细胞(BMSC)的分离、培养和鉴定的方法，为整个实验奠定基础。2．体外研究PLLA／明胶的降解性能及孔隙率。3．测定BMSC的增殖率及平均倍增时间并对BMSC和PLLA／明胶的黏附性进行初步研究。4．生研究骨髓间充质干细胞(BMSC)复合PLLA／明胶修复兔膝关节全层软骨缺损的疗效。方法1．BMSC取自4-6月龄2.5-3.5千克的青紫兰兔，体外分离培养后行细胞表型的鉴定。2．将PLLA／明胶置于PBS液中测定其降解率；3．用液体置换法测其孔隙率；4．测定原代和传代骨髓间充质干细胞增殖率和平均倍增时间并绘制增殖率曲线，比较不同代数BMSC的增殖能力；5．测定BMSC与PLLA／明胶的黏附率；6．将BMSC种植于PLLA／明胶支架上体外培养，再移植于兔膝关节全层软骨缺损模型处。选用健康的青紫兰兔36只，随机分成A、B、C三个处理组各12只，A处理组双侧股骨髁间窝软骨缺损处植入PLLA／明胶吸附体外分离培养的自体骨髓间充质干细胞复合物；B处理组单纯植入PLLA／明胶；C处理组不作任何植入。分别于术后4、8、12周各处死4只兔子，取材进行大体、组织学及免疫组化染色观察，根据关节软骨组织学计分标准进行评分，数据输入SPSS 10.0软件统计分析，比较各组的评分差异是否具有统计学意义。结果1．通过本实验方法分离和培养的BMSC形态特征明显，细胞免疫化学染色实验组BMSC均表达特异性抗原CD44；造血干细胞特异性抗原CD34，成纤维细胞特异性抗原Laminin及软骨细胞特异性标记物Ⅱ型胶原单克隆抗体均为阴性表达。2．LPLLA／明胶的降解随时间的延长逐渐加速，完全降解大约需要10-12周。3．所测孔隙率为67.15。4．传代后的第二代细胞具有较强的增殖率，是软骨关节缺损的修复中比较理想的细胞。5．浓度为1×10~5的细胞与PLLA／明胶具有较高的黏附率。6．术后12周取材发现，骨髓间充质干细胞复合PLLA／明胶所修复组织为透明软骨样修复；而单纯PLLA／明胶移植组和空白组为纤维性修复。对术后12周大体及组织学形态进行评分。按完全随机设计进行方差分析和SNK-q检验，结果显示，BMSC／PLLA／明胶组明显优于PLLA／明胶植入组和空白对照组(P＜0.05)；PLLA／明胶组优于空白组(P＜0.05)。结论1．本实验分离培养获得的细胞是纯度较高的BMSC，它可作为种子细胞用于组织工程研究。2．LPLLA／明胶的降解曲线和BMSC的增殖曲线相一致；第二代细胞增殖活跃；3．浓度为1×10~5的细胞和PLLA／明胶具有较高的黏附率，是软骨组织工程中比较理想的种子细胞。4．运用软骨组织工程的原理，以PLLA／明胶为支架材料的自体骨髓间充质干细胞移植是一种修复软骨缺损的行之有效的方法。