论文部分内容阅读
WSS25是从传统中药天麻中提取获得的均一多糖经硫酸化后制备而成的α-(1-4)为主链,C-6位上有α-(1-4)连接支链的硫酸化葡聚糖,且硫酸化位点在C-6位上。以前的研究表明WSS25可靶向bonemorphogenetieprotein2(BMP2)及其受体,影响血管生成促进因子DNA-bindingproteininhibitorID-1(Id1)的功能,通过抑制BMP/Smad/Id1信号通路抑制血管生成,进而阻滞裸鼠移植瘤的生长,是一新的抗肿瘤候选药物,已获得我国及美国专利局授权。虽然WSS25能强烈抑制血管生成,但其对血管生成的调控机制仍不是很清楚。为深入研究WSS25调控血管生成的机理,我们首先将WSS25处理后的人微血管内皮细胞humanmicrovascularendothelialcells(HMEC-1)进行人全基因组microRNA(miRNA)芯片分析,发现WSS25处理后的HMEC-1中,25个miRNAs的表达水平上调,13个miRNAs表达水平下调,这其中包括miR-210和miR-885-3p。 进一步研究表明,WSS25能抑制HMEC-1细胞中Dicer的表达水平,该酶是miRNA生物合成过程中的关键酶之一,并且这种抑制作用呈现明显的剂量依赖性。当Dicer沉默时,HMEC-1细胞管腔形成和miR-210的表达都受到抑制,而Ephrin-A3的表达则得到促进。反之,Dicer能促进HMEC-1细胞管腔形成和miR-210的表达,同时抑制Ephrin-A3的表达。此外,WSS25显著抑制HMEC-1细胞中miR-210的表达,促进Ephrin-A3的表达。anti-miR-210将miR-210的表达沉默,则抑制HMEC-1细胞迁移和管腔形成,上调Ephrin-A3的表达。另一方面,miR-210可直接靶向Ephrin-A3的3untranslatedregion(3UTR),并且Ephrin-A3过表达能抑制HMEC-1细胞的管腔形成能力,Ephrin-A3的沉默则促进管腔形成,这些结果表明Ephrin-A3是miR-210的一个功能性靶基因。Dicer,miR-210以及Ephrin-A3沉默对HMEC-1细胞管腔形成的促进作用可部分被WSS25所抑制。进一步,我们还发现,WSS25能显著抑制Dicer转录因子Sox4、MITF、TAp63的表达以及Dicer启动子的荧光素酶活性,即WSS25可在转录水平上抑制Dicer活性,但Dicer蛋白较稳定,WSS25不影响Dicer蛋白的降解水平。我们的研究结果表明,WSS25对血管生成的抑制作用可通过在转录水平上抑制Dicer的活性,进而抑制miR-210的功能,促进miR-210靶基因Ephrin-A3的表达来实现,并且该Dicer/miR-210/Ephrin-A3信号通路与之前报道的BMP/Smad/Id1信号通路是相互独立的。 我们的研究还发现miR-885-3p在体内外能显著抑制血管生成。通过miRNAs靶标预测软件,我们认为bonemorphogeneticproteinreceptor,typeⅠA(BMPR1A)是miR-885-3p可能的靶标之一。双荧光素酶报告基因实验证实了miR-885-3p可靶向BMPR1A,下调其表达,并进一步抑制HMEC-1细胞中BMPR1A,Smad1/5/8的磷酸化,以及血管生成促进因子Id1的功能,从而抑制血管生成。上述结果提示我们,miR-885-3p可通过调节BMP/Smad/Id1信号通路来调控血管生成。更重要的是,靶基因BMPR1A的沉默能抑制血管生成,阻滞Smad/Id1信号通路,与miR-885-3p作用一致;反之,BMPR1A能促进血管生成,激活Smad/Id1信号通路;rescue实验的结果也表明,在miR-885-3p过表达的细胞中,BMPR1A能部分拮抗miR-885-3p对血管生成的抑制作用。这些结果表明,在内皮细胞中,miR-885-3p对血管生成的抑制作用至少部分是通过抑制BMPR1A的功能,进一步阻滞Smad/Id1信号通路来实现的。另一方面,我们还检测了不同组织来源的细胞中miR-885-3p与BMPR1A的表达水平,总的来说,miR-885-3p的表达水平与BMPR1A的表达水平呈负相关性,比如与正常肝细胞L02相比,在肝癌细胞BEL-7402,肺癌细胞A549,神经胶质瘤细胞U-87MG,宫颈癌细胞HeLa,结肠癌细胞HT-29,胰腺癌细胞AsPC-1,乳腺癌细胞MCF-7和SK-BR-3中,miR-885-3p的表达水平较低而BMPR1A表达水平较高;在肝癌细胞HuH-7,成神经瘤细胞SK-N-SH中,miR-885-3p的表达水平较高而BMPR1A表达水平较低。但在某些细胞中miR-885-3p的表达水平与BMPR1A的表达水平并不呈现类似的负相关性,比如在胰腺癌细胞PANC-1和BxPC-3,肝癌细胞SMMC-7721中miR-885-3p的表达水平与BMPR1A的表达水平都很高。相应的,在HT-29结肠癌细胞中,miR-885-3p也能抑制BMPR1A的表达,进一步抑制Smad/Id1信号通路。通过体内实验,我们验证了miR-885-3p能抑制HT-29结肠癌细胞裸鼠移植瘤的生长,且这种抑制作用是通过抑制血管生成,下调BMPR1A以及Smad/Id1信号通路实现的。上述实验结果为miR-885-3p通过靶向BMPR1A,下调Smad/Id1信号通路来抑制肿瘤血管生成提供了有力的证据。 综上所述,我们的研究首次证实了Dicer和miRNAs在多糖介导的血管生成抑制作用中发挥重要的作用,表明WSS25不仅可以调节血管生成相关因子,还能影响miRNAs的功能。以WSS25为探针,首次阐明了miR-885-3p在血管生成中的全新功能及其作用机制。上述结果证明了大分子多糖也可作为探针来探索miRNAs的功能机制,这一发现拓展了基于小分子为探针的化学生物学的范畴。同时,本研究也拓宽了我们关于WSS25在血管生成中作用的理解,也为从miRNAs的角度进行基于WSS25的新药研发提供了一定的线索和理论基础。